Chrysanthemyl Diphosphate Synthase Operates in Planta as a Bifunctional Enzyme with Chrysanthemol Synthase Activity
- 作者
- Ting Yang, Liping Gao, Hao Hu, Geert Stoopen, Caiyun Wang, Maarten A. Jongsma
- 单位
- Business Unit PRI-Bioscience, Wageningen UR, P.O. Box 16, 6700 AA Wageningen, The Netherlands; Laboratory of Entomology, Wageningen UR, P.O. Box 8031, 6700 EH Wageningen, The Netherlands; Laboratory of Plant Physiology, Wageningen UR, P.O. Box 658, 6700 AR Wageningen, The Netherlands; Key Laboratory for Biology of Horticultural Plants, Ministry of Education, College of Horticulture and Forestry Sciences, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China
- 杂志
- J. Biol. Chem.（2014）
- DOI
- 10.1074/jbc.M114.623348
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
传统上认为菊基二磷酸合酶(CDS)仅催化两分子DMAPP缩合生成CPP，但实验发现它还能催化CPP水解为chrysanthemol，是一个双功能酶。需要重新认识其催化功能和命名。
研究策略
通过克隆全长cDNA、在大肠杆菌中表达纯化重组酶，进行体外酶动力学分析；采用定点突变研究NDXXD基序的功能；通过GFP融合蛋白确定亚细胞定位；并在转基因烟草中过表达CDS验证体内功能。
核心内容
该研究重新审视了除虫菊中菊基二磷酸合酶（CDS）的催化功能。传统观点认为CDS仅催化两分子DMAPP缩合生成菊基二磷酸（CPP），但实验发现该酶实际上是一个双功能酶，还能将CPP进一步水解为chrysanthemol。研究者从除虫菊中克隆了TcCDS全长cDNA，在大肠杆菌中表达纯化重组酶，通过体外酶动力学分析证实其催化CPP生成chrysanthemol的过程符合Michaelis-Menten动力学，Km为196±23 μM，kcat为3.3±0.2×10⁻³ min⁻¹。在DMAPP存在时，chrysanthemol产量在40–150 μM DMAPP范围内高于CPP，半最大活性浓度约为100 μM，而超过300 μM的DMAPP则抑制chrysanthemol合成但促进CPP积累。定点突变实验显示NDXXD基序中的N283D和N283G突变使两种活性完全丧失，说明该基序对双功能催化均至关重要。GFP融合蛋白定位分析表明CDS前54个氨基酸为质体靶向信号。在转基因烟草中过表达CDS后，chrysanthemol释放速率达到0.12–0.16 μg h⁻¹ g⁻¹ FW，验证了其体内功能。该发现揭示了除虫菊酯生物合成中单萜分支的新步骤，并建议将CDS更名为chrysanthemol synthase。
创新点
首次证明CDS是兼具异戊烯基转移酶和萜烯合酶活性的双功能酶；提出将CDS更名为chrysanthemol synthase；阐明NDXXD基序中的天冬酰胺对两种活性均至关重要。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(AI) | 异戊二烯/萜类代谢 | TcCDS (JX913536) | Chrysanthemyl diphosphate synthase (CDS) | 催化 | 重组表达、纯化与体外酶活测定 |
| Escherichia coli BL21(AI) | 萜类代谢 | TcCDS-N283D | CDS-N283D突变体 | 催化 | 定点突变导致催化活性丧失 |
| Escherichia coli BL21(AI) | 萜类代谢 | TcCDS-N283G | CDS-N283G突变体 | 催化 | 定点突变导致催化活性丧失 |
| Nicotiana tabacum 'Samsun' | 除虫菊酯/单萜生物合成 | TcCDS | CDS | 催化 | 过表达后叶片释放chrysanthemol |
| 烟草原生质体（来自转基因烟草） | 亚细胞定位 | CDS信号肽-GFP融合基因 | CDS(1-54aa)-GFP | 区室化 | 证实N端信号肽靶向质体 |
关键发现
- CDS催化CPP生成chrysanthemol，符合Michaelis-Menten动力学，Km=196±23 μM，kcat=3.3±0.2×10^-3 min^-1
- 在DMAPP存在时，chrysanthemol产量在40-150 μM DMAPP范围内高于CPP，半最大活性浓度约100 μM
- 高浓度DMAPP（>300 μM）抑制chrysanthemol合成但增加CPP积累
- 转基因烟草chrysanthemol释放速率为0.12–0.16 μg h^-1 g^-1 FW
- N283D和N283G突变使两种活性完全丧失
- CDS的前54个氨基酸为质体靶向信号。
研究结论
CDS在体内外均表现为双功能酶，能依次将DMAPP转化为CPP并进一步水解为chrysanthemol，应更名为chrysanthemol synthase。这一发现揭示了除虫菊酯生物合成中单萜分支的新步骤。