高级醇 · 代谢工程文献库

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Identification of a Fungal 1,8-cineole Synthase from Hypoxylon sp. with Common Specificity Determinants to the Plant Synthases

作者
Jeffrey J Shaw, Tetyana Berbasova, Tomoaki Sasaki, Kyra Jefferson-George, Daniel J Spakowicz, Brian F Duncan, Carolina E. Portero, Alexandra Narváez-Trujillo, Scott A Strobel
单位
Department of Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University; Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania; Laboratorio de Biotecnología Vegetal, Pontificia Universidad Católica del Ecuador
杂志
Journal of Biological Chemistry（2015）
DOI
10.1074/jbc.M114.636159
所属领域
代谢工程
关键词
enzyme mechanismfungimutagenesisphylogeneticsterpenoid
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解决的核心问题

真菌中一直没有发现单萜合酶，1,8-桉叶素（cineole）在真菌中的生物合成基因尚未鉴定，需要从真菌中找出负责1,8-桉叶素合成的萜烯合酶并研究其催化机制。

研究策略

对真菌挥发物进行GC/MS筛选，对产1,8-桉叶素的菌株E7406B进行基因组测序，通过系统发育分析和Pfam注释鉴定候选萜烯合酶基因，在E. coli中异源表达，利用体外酶活测定和定点突变解析酶学特性与催化机理。

研究路线图

100%
研究问题：真菌中单萜合酶缺失，1,8-桉叶素合成基因未鉴定
策略：GC/MS筛选+基因组测序
关键改造：鉴定13个TPS基因，Hyp3为单萜合酶
关键改造：异源表达与体外酶活测定
关键改造：定点突变N136解析催化机制
结果：Hyp3产物为1,8-桉叶素(90%)+D-柠檬烯(5%)
结果：kcat=17.7±2.0/min，Km=2.5±0.6μM，对FPP无活性
结果：E.coli中表达产量达21±11mg/L（提高230倍）
结论：真菌首个单萜合酶，与植物趋同进化，可用于微生物生产
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核心内容

该研究首次在真菌中鉴定出单萜合酶，填补了真菌缺乏单萜合酶认知的空白。研究人员通过气相色谱-质谱筛选真菌挥发物，对产1,8-桉叶素的Hypoxylon sp. E7406B菌株进行基因组测序，结合系统发育分析和Pfam注释鉴定出13个假定萜烯合酶基因，其中hyp3编码的Hyp3被证实为1,8-桉叶素合酶，产物中1,8-桉叶素约占90%、D-柠檬烯约占5%。纯化的Hyp3对香叶基焦磷酸的kcat为17.7±2.0 min⁻¹，Km为2.5±0.6 μM，对法尼基焦磷酸无活性。定点突变揭示活性位点天冬酰胺N136对水捕获和产物特异性至关重要，N136V/I突变将产物转为柠檬烯，N136S/A突变产生月桂烯。在E. coli中单独表达hyp3时产量约0.09 mg/L，偶联甲羟戊酸途径质粒pJBEI-2999后产量提升至21±11 mg/L，较真菌原始产量0.54 mg/L提高约38倍。该发现证明真菌萜烯合酶是与植物酶趋同进化的酶资源，可作为微生物生产萜烯类化合物的新工具。

创新点

首次在真菌中鉴定出单萜合酶（Hyp3），证实其与植物1,8-桉叶素合酶共享活性位点天冬酰胺实现水捕获和特异性的趋同进化机制，并证明真菌萜烯合酶可应用于微生物萜烯生产。

研究对象（8）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Escherichia coli DH5α 甲羟戊酸途径（pJBEI-2999） hyp3 Hyp3 催化 异源表达鉴定为真菌1,8-桉叶素合酶，主要产物1,8-桉叶素（90%）和D-柠檬烯（5%），在含pJBEI-2999时产量达21±11 mg/L。
Escherichia coli BL21 体外萜烯合成 hyp3 Hyp3 催化 纯化酶体外表征：对GPP的kcat=17.7±2.0 min^-1，Km=2.5±0.6 μM，对FPP无活性。
Hypoxylon sp. E7406B 真菌萜烯生物合成 hyp3（及hyp1-11） Hyp3 催化 原始产1,8-桉叶素菌株，基因组45.3 Mbp，11551个蛋白编码基因，13个TPS基因中hyp3负责1,8-桉叶素合成。
Escherichia coli DH5α 甲羟戊酸途径（pJBEI-2999） hyp1 Hyp1 催化 表达产物为trans-nerolidol（>95%峰面积），是倍半萜合酶。
Escherichia coli DH5α 甲羟戊酸途径（pJBEI-2999） hyp2 Hyp2 催化 主要产物δ-cadinene（59%峰面积），另有21个次要峰。
Escherichia coli DH5α 甲羟戊酸途径（pJBEI-2999） hyp4 Hyp4 催化 产生未知倍半萜（主峰占78%），伴随微量单萜（<1%）。
Escherichia coli DH5α 甲羟戊酸途径（pJBEI-2999） hyp5 Hyp5 催化 主要产物为α-bulnesene（27%）、β-guaiene（5%）及未知含azulene结构化合物。
Escherichia coli DH5α 甲羟戊酸途径（pJBEI-2999） hyp3（N136V/I/S/A突变体） Hyp3突变体 催化 N136V/I产生limonene，N136S/A产生myrcene，N136A还产生farnesene异构体，表明N136对水捕获和单萜特异性至关重要。

关键发现

  1. 从Hypoxylon sp. E7406B基因组中鉴定出13个假定萜烯合酶基因，其中hyp3编码1,8-桉叶素合酶，为真菌中首个单萜合酶
  2. Hyp3产物中1,8-桉叶素约占90%、D-柠檬烯约占5%
  3. 纯化Hyp3对GPP的kcat为17.7±2.0 min^-1，Km为2.5±0.6 μM，对FPP无可检测活性
  4. 真菌E7406B的1,8-桉叶素产量为0.54±0.18 mg/L，在E. coli DH5α中单独表达hyp3时约0.09 mg/L，而带有pJBEI-2999甲羟戊酸途径质粒时产量增至21±11 mg/L，较无质粒提高至少230倍、较真菌提高约38倍
  5. N136V/I突变使产物变为limonene，N136S/A突变产生myrcene，N136A突变还产生farnesene异构体。

研究结论

首次鉴定出真菌来源的1,8-桉叶素合酶Hyp3，其通过活性位点天冬酰胺N136实现水攻击和单萜底物特异性，与植物合成酶机制相同但序列差异大，是趋同进化的典型案例；真菌萜烯合酶是尚未充分开发的酶资源，可用于微生物生产萜烯类化合物。