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Domain analysis and engineering of multifunctional \(\beta\) -carotene synthase, CrtIBY, for lycopene and phytoene production

作者
Kenshi Watanabe, Ami Oda, Akiko Nagano, Ryota Sato, Yusuke Hashima, Tsunehiro Aki
单位
11-3-1 Kagamiyama, Higashi-Hiroshima 739-8530, JAPAN
杂志
Journal of Oleo Science（2026）
DOI
10.5650/jos.ess26022
所属领域
代谢工程
关键词
Aurantiochytrium sp异源表达类胡萝卜素生产蛋白质工程
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解决的核心问题

多功能β-胡萝卜素合酶CrtIBY高效合成β-胡萝卜素但几乎不积累中间产物八氢番茄红素和番茄红素，难以用于这些有用中间体的生产。

研究策略

利用AlphaFold预测和分子对接分析CrtIBY的结构与底物结合，通过删除N端FAD结合基序和定点突变番茄红素环化酶基序，在酿酒酵母中异源表达改造后的CrtIBY突变体，以分别积累八氢番茄红素和番茄红素。

研究路线图

100%
研究问题：CrtIBY合成β-胡萝卜素高效但几乎不积累中间体，难以生产八氢番茄红素和番茄红素
策略：AlphaFold3结构预测与分子对接分析，设计N端FAD结合基序删除和C端环化酶基序定点突变
关键改造1：CrtIBY-Δ75缺失N端75氨基酸（去FAD基序），失去脱氢酶活性，积累八氢番茄红素0.5 mg/L
关键改造2：CrtIBY-mY突变环化酶基序（P1123G/E1125A/E1126A），失去环化活性，积累番茄红素2.4 mg/L
结果：野生型产β-胡萝卜素3.1-4.0 mg/L；Δ75突变体产八氢番茄红素0.5 mg/L；mY突变体产番茄红素2.4 mg/L不产β-胡萝卜素；分子对接显示环化酶基序与底物距离19.5/20.7 Å
结论：CrtIBY三功能域模块化独立，FAD基序对脱氢酶活性必需，环化酶基序对环化活性关键；消除相应功能可定向生产八氢番茄红素或番茄红素，为工业化提供新催化剂
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核心内容

该研究对源自Aurantiochytrium sp. KH105的三功能β-胡萝卜素合酶CrtIBY进行了结构域功能解析与改造，旨在打破其高效合成β-胡萝卜素而几乎不积累中间产物的局限。作者利用AlphaFold预测和分子对接分析酶结构与底物结合模式，随后在酿酒酵母中异源表达一系列突变体。通过删除N端75个氨基酸以去除FAD结合基序，获得突变体CrtIBY-Δ75，其完全丧失八氢番茄红素脱氢酶活性，转而积累八氢番茄红素0.5 mg/L且以cis异构体为主；通过对C端环化酶基序实施定点突变（P1123G/E1125A/E1126A），获得的CrtIBY-mY突变体完全失去环化酶功能，积累番茄红素2.4 mg/L且不生成β-胡萝卜素，而野生型菌株的β-胡萝卜素产量为3.1–4.0 mg/L。分子对接显示C端环化酶基序与N端底物结合位点在空间上相对分离。结果表明CrtIBY的脱氢、合成与环化三个功能域模块化且相对独立，通过定向去除或突变特定功能基序，可将该多功能酶改造成专一生产八氢番茄红素或番茄红素的高效生物催化剂，为类胡萝卜素中间体的工业化制备提供了新工具。

创新点

首次对源自Aurantiochytrium sp. KH105的三功能β-胡萝卜素合酶CrtIBY进行结构域功能研究；通过删除FAD结合基序获得只产八氢番茄红素的突变体CrtIBY-Δ75；通过定点突变C端番茄红素环化酶基序（P1123G/E1125A/E1126A）获得只产番茄红素的突变体CrtIBY-mY；利用AlphaFold3结构和分子对接指导突变设计。

研究对象（3）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Saccharomyces cerevisiae INVSc1 类胡萝卜素生物合成 CrtIBY CrtIBY（三功能β-胡萝卜素合酶，含CrtI、CrtB、CrtY结构域） 催化 野生型，催化GGPP→β-胡萝卜素，酵母中β-胡萝卜素产量3.1-4.0 mg/L
Saccharomyces cerevisiae INVSc1 类胡萝卜素生物合成 CrtIBY-Δ75 CrtIBY-Δ75（缺失N端75个氨基酸，无FAD结合基序） 催化 失去CrtI脱氢酶活性，保留CrtB活性，积累八氢番茄红素0.5 mg/L
Saccharomyces cerevisiae INVSc1 类胡萝卜素生物合成 CrtIBY-mY CrtIBY-mY（C端番茄红素环化酶基序突变：P1123G/E1125A/E1126A） 催化 失去CrtY环化酶活性，积累番茄红素2.4 mg/L

关键发现

  1. 野生型CrtIBY在酿酒酵母中积累β-胡萝卜素3.1-4.0 mg/L
  2. CrtIBY-Δ75（缺失N端75个氨基酸，去除FAD结合基序）完全失去八氢番茄红素脱氢酶活性，积累八氢番茄红素0.5 mg/L（cis异构体为主）
  3. CrtIBY-mY（C端番茄红素环化酶基序突变）完全失去环化酶活性，积累番茄红素2.4 mg/L，不产生β-胡萝卜素。分子对接显示C端环化酶基序(E1125/E1126)距番茄红素中心19.51 Å，N端基序(E991/E992)为20.69 Å。

研究结论

CrtIBY的CrtI、CrtB和CrtY三个功能域模块化且相对独立，FAD结合基序对脱氢酶活性必不可少，C端番茄红素环化酶基序对环化活性至关重要。通过去除FAD结合基序或突变环化酶基序，可将该多功能酶改造为高效生产八氢番茄红素或番茄红素的生物催化剂，为相关产品工业化提供新工具。