高级醇 · 代谢工程文献库

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Heterologous fermentation of a diterpene from Alternaria brassicicola

作者
Julia Arens, Dominik Bergs, Mirja Mewes, Juliane Merz, Gerhard Schembecker, Frank Schulz
单位
Ruhr University Bochum, Department for Chemistry and Biochemistry; TU Dortmund University, Department of Biochemical and Chemical Engineering; TU Dortmund University, Department of Chemistry and Chemical Biology
杂志
Mycology: An International Journal on Fungal Biology（2014）
DOI
10.1080/21501203.2014.917735
所属领域
代谢工程
关键词
anti-tumourdirected evolutionenzyme engineeringheterologous fermentationmetabolic engineeringterpenes
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解决的核心问题

fusicoccane类二萜前体fusicocca-2,10(14)-diene在酿酒酵母中异源发酵产量低、副产物多、遗传不稳定，且关键酶AbFS的活性/可溶性可能是瓶颈

研究策略

对酿酒酵母工程菌进行发酵条件优化（培养基选择、pH控制、氧供给、补料分批、原位产物吸附），并通过密码子优化、随机突变（定向进化）、域拆分表达等方法探索酶层面的瓶颈

研究路线图

100%
初始问题：FCdiene异源发酵产量低（6 mg/L）、副产物多、遗传不稳定
整体策略：发酵条件优化 + 酶层面改造探索（密码子优化、定向进化、域拆分）
发酵条件优化：选择性培养基SD + 琥珀酸缓冲 + 补料分批（1.5%葡萄糖）
原位产物吸附：廉价树脂Lewatit替代C18硅胶
酶改造尝试（I）：密码子优化abfsSC→未改善产量
酶改造尝试（II）：定向进化筛选3万+克隆→无可溶表达改善变体
酶改造突破：域拆分表达→GGPPS域可溶高，FCyc域可溶低但仍有活性
关键结果：FCdiene产量提升至约20 mg/L（120 h，3.3倍提升）
结论：发酵优化已近瓶颈，FCyc域低可溶性表达是未来酶工程改造核心靶点
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核心内容

该研究针对fusicocca-2,10(14)-diene（FCdiene）在酿酒酵母中异源发酵产量低、副产物多、遗传不稳定等问题，从发酵工艺和酶工程两个层面开展系统优化。在发酵层面，通过将培养基从富营养的YPD更换为选择性SD-His-Leu-Ura，使重组菌株的质粒稳定性显著提升，产量提高两倍；结合琥珀酸缓冲、补料分批补加1.5%葡萄糖以及氧限制条件，120小时内FCdiene产量由初始的6 mg/L稳定提升至约20 mg/L。发酵中还鉴定出两种分子量为272的副产物，选择性培养基可明显减少其生成。此外，引入低成本聚合物树脂Lewatit VP OC 1064 MD PH进行原位产物吸附，替代昂贵的C18硅胶。在酶工程层面，密码子优化和针对超过30,000个克隆的定向进化均未显著改善AbFS的可溶表达；将AbFS拆分为GGPPS域和FCyc域单独表达后发现，FCyc域可溶表达量低但仍有催化活性，是限制整体产量的关键瓶颈。上述结果表明，单纯优化发酵条件可将产量提高三倍以上，但进一步跃升需针对FCyc域进行理性酶工程改造，这为后续研究指明了靶点。

创新点

鉴定了两种FCdiene生物合成副产物（化合物1和2）；发现氧限制条件有利于FCdiene发酵；通过选择性培养基和补料分批将产量从6 mg/L提升至约20 mg/L；引入低成本聚合物树脂Lewatit VP OC 1064 MD PH替代昂贵的C18硅胶；通过域拆分表达发现FCyc域是低可溶表达的主要原因，为后续酶工程提供靶点

研究对象（4）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1c 甲羟戊酸途径/二萜生物合成 abfs AbFS 催化 来自Alternaria brassicicola的双模块fusicoccadiene合酶，催化GGPP合成及环化生成FCdiene
Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1c 甲羟戊酸途径 thmgr1 tHMGR1 催化 截短HMG-CoA还原酶，去除N端调控域，提高甲羟戊酸途径通量
Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1c 甾醇代谢 upc2-1 UPC2-1 调控 突变转录因子，促进有氧条件下甾醇摄取，增加异源萜类前体供应
Escherichia coli 二萜生物合成 fcyc, ggpps FCyc, GGPPS 催化 分别表达AbFS的两个催化域，验证其独立活性，GGPPS域可溶表达高，FCyc域可溶表达低

关键发现

  1. 初始摇瓶发酵FCdiene产量为6 mg/L
  2. 通过使用选择性培养基SD-His-Leu-Ura、补料分批（补加1.5%葡萄糖）和琥珀酸缓冲，产量可重复地提高至约20 mg/L（120 h）
  3. 选择性培养基相比YPD使产量提高两倍
  4. 在YPD中，重组菌株在20 h内丢失全部三个质粒
  5. 提高氧供给（180 rpm vs 110 rpm）导致产量降低但不显著
  6. 发酵中鉴定出两种副产物（化合物1和2，m/z 272），在选择性培养基中副产物减少
  7. 密码子优化的abfsSC未改善产量
  8. 定向进化筛选了超过30,000个克隆，未获得可溶性表达显著提高的AbFS变体
  9. 单独表达AbFS的两个域时，GGPPS域可溶表达量高，FCyc域可溶表达量低但仍具有催化活性

研究结论

通过发酵条件优化（选择性培养基、补料分批、氧限制、琥珀酸缓冲、聚合物树脂原位产物吸附）使FCdiene产量达到约20 mg/L，但进一步提高受限于AbFS酶本身。定向进化全酶未成功，将AbFS拆分后表明FCyc域可溶表达低，是未来酶工程改造的起点