Metabolic engineering of Escherichia coli W3110 strain by incorporating genome-level modifications and synthetic plasmid modules to enhance L-Dopa production from glycerol
- 作者
- Arunangshu Das, Neetu Tyagi, Anita Verma, Sarfaraz Akhtar, Krishna J. Mukherjee
- 单位
- School of Biotechnology, Jawaharlal Nehru University, New Delhi, India; Nagarjuna Fertilizers and Chemicals Limited, Kakinada, Andhra Pradesh, India
- 杂志
- Preparative Biochemistry and Biotechnology（2018）
- DOI
- 10.1080/10826068.2018.1487851
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
通过代谢工程改造大肠杆菌W3110，利用甘油高效生产L-Dopa，解决现有化学合成方法收率低、对映选择性差以及生物合成产量低的问题。
研究策略
整合基因组水平修饰（敲除tyrR、pykF、serA，敲入反馈脱敏的aroG*）与两个合成质粒模块（pY3酪氨酸模块和pMAL-Kan Dopa模块），利用组成型启动子的泄漏表达实现平衡的通量，以甘油作为碳源进行补料分批发酵，并通过指数补料策略优化生产。
核心内容
该研究通过整合基因组水平修饰与合成质粒模块，对大肠杆菌W3110进行代谢工程改造，以实现以甘油为碳源的高效L-Dopa生产。在基因组层面，敲除了tyrR、pykF和serA三个基因，并整合了反馈脱敏的aroG*突变；在质粒层面，构建了pY3酪氨酸合成模块和pMAL-Kan Dopa转化模块，利用组成型启动子的泄漏表达实现代谢通量的平衡供给，避免过度表达途径酶对细胞稳态的破坏。通过补料分批发酵，研究比较了恒定补料和指数补料两种策略，并结合实时监测CO2和残留甘油识别出生长相关与生长非依赖两个生产阶段。结果表明，最佳菌株S2在未诱导条件下摇瓶产量达0.95 g/L，优于诱导条件；指数补料策略下L-Dopa最终产量达12.5 g/L，较恒定补料提高了1.2 g/L，较此前最高报道的8.67 g/L提升约40%。此外，以甘油替代葡萄糖可显著减少乙酸积累，发酵中pH最低为5.3，而葡萄糖组降至4.2。该工作表明，平衡代谢通量而非过度表达途径酶是长周期高效生产的关键，甘油作碳源与指数补料策略可有效利用生长非依赖阶段的生产潜力，为L-Dopa的生物合成提供了可行的产业化路径。
创新点
（1）采用最小化宿主修饰和组成型表达策略，避免过度表达途径酶导致的细胞稳态破坏；（2）发现甘油比葡萄糖更适合该工程菌株，显著减少乙酸生成；（3）通过实时监测CO2和残留甘油，识别出生长的生产阶段和生长非依赖的生产阶段，并采用指数补料策略提高产量；（4）实现了L-Dopa产量较此前最高报道提高约40%。
研究对象（11）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli W3110 | 芳香族氨基酸生物合成 | aroG | 3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶（DAHP合成酶） | 催化 | 基因组中被反馈脱敏的aroG*替换，以解除苯丙氨酸反馈抑制 |
| Escherichia coli W3110 | 芳香族氨基酸生物合成 | aroG* | 反馈脱敏的DAHP合成酶 | 催化 | 敲入基因组替换野生型aroG，增强DAHP合成并解除反馈抑制 |
| Escherichia coli W3110 | 芳香族氨基酸生物合成 | aroL | 莽草酸激酶 | 催化 | 位于pY3质粒，在pTRC启动子下表达，增强限速步骤 |
| Escherichia coli W3110 | 芳香族氨基酸生物合成 | aroC | 分支酸合酶 | 催化 | 位于pY3质粒，在lacUV5启动子下表达 |
| Escherichia coli W3110 | 芳香族氨基酸生物合成 | tyrB | 芳香族氨基酸氨基转移酶 | 催化 | 位于pY3质粒，在lacUV5启动子下表达 |
| Escherichia coli W3110 | 芳香族氨基酸生物合成 | tyrA | 反馈脱敏的酪氨酸合酶 | 催化 | 位于pY3质粒，参与酪氨酸合成 |
| Escherichia coli W3110 | 芳香族氨基酸生物合成 | aroA | 3-磷酸莽草酸1-羧乙烯基转移酶（EPSP合酶） | 催化 | 位于pY3质粒，在pTRC启动子下表达 |
| Escherichia coli W3110 | L-酪氨酸转化生成L-Dopa | hpaBC | 4-羟基苯乙酸3-羟化酶 | 催化 | 位于CS1质粒，组成型表达，催化酪氨酸羟基化生成L-Dopa |
| Escherichia coli W3110 | 芳香族氨基酸生物合成调控 | tyrR | 转录调控因子TyrR | 调控 | 敲除，解除对芳香族氨基酸生物合成和转运的转录抑制 |
| Escherichia coli W3110 | 糖酵解/芳香族氨基酸前体供给 | pykF | 丙酮酸激酶 | 催化 | 敲除，减少PEP流向丙酮酸，增加PEP用于DAHP合成 |
| Escherichia coli W3110 | 丝氨酸/芳香族氨基酸竞争通路 | serA | 磷酸甘油酸脱氢酶 | 催化 | 敲除，减少3-磷酸甘油酸向丝氨酸和组氨酸分支的碳流 |
关键发现
- 最佳菌株S2（ΔpykF ΔtyrR ΔserA aroG*，携带pY3和CS1）在未诱导条件下摇瓶产量达0.95 g/L，优于诱导条件
- 补料分批发酵中，指数补料策略使L-Dopa最终产量达到12.5 g/L，较恒定补料的11.37 g/L提高1.2 g/L，比此前最高报道（8.67 g/L）提高约40%
- 以甘油为碳源时pH最低为5.3，而以葡萄糖为碳源时pH降至4.2，表明甘油能显著减少乙酸积累
- 生产过程分为生长相关（8-10 h）和生长非依赖（14-16 h）两个阶段，指数补料在生长非依赖阶段增强了产物合成速率且未增加酸产量。
研究结论
平衡代谢通量而非过度表达途径酶是长期高效生产L-Dopa的关键；甘油作为碳源可减少乙酸生成，有利于延长生产期；指数补料策略能有效利用生长非依赖阶段的生产潜力，实现高水平L-Dopa生产。