高级醇 · 代谢工程文献库

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A novel jasmonate- and elicitor-responsive element in the periwinkle secondary metabolite biosynthetic gene Str interacts with a jasmonate- and elicitor-inducible AP2-domain transcription factor, ORCA2

作者
Frank L.H.Menke, Anthony Champion, Jan W.Kijne, Johan Memelink
单位
Institute of Molecular Plant Sciences, Clusius Laboratory, Leiden University, Wassenaarseweg 64, 2333 AL Leiden, The Netherlands
杂志
The EMBO Journal（1999）
DOI
10.1093/emboj/18.16.4455
所属领域
植物代谢工程 / 合成生物学
关键词
Catharanthus roseusEREBPStrictosidine synthasecis-elementtranscriptional regulation
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解决的核心问题

茉莉酸（JA）和激发子如何通过顺式作用元件和转录因子调控长春花次生代谢生物合成基因Str的表达

研究策略

通过启动子缺失分析、块扫描突变、酵母单杂交筛选、凝胶迁移实验（EMSA）和瞬时共转化实验，鉴定JA和激发子响应元件及其结合蛋白

研究路线图

100%
研究问题：JA和激发子如何调控Str基因表达？
策略：启动子缺失分析+酵母单杂交+EMSA+瞬时共转化
关键改造①：Str启动子缺失突变体与阻断突变(M2-M5)
关键改造②：JERE元件(RV区42bp)鉴定及四聚体实验
关键改造③：酵母单杂交筛选ORCA1/ORCA2及EMSA验证
结果：ORCA2结合JERE激活Str启动子2.9倍，响应MeJA/激发子
结论：JERE(含GCC-box样序列)+ORCA2构成JA响应关键调控模块
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核心内容

该研究以长春花萜类吲哚生物碱生物合成关键基因Str为对象，探究茉莉酸（JA）和激发子调控其表达的分子机制。通过启动子缺失分析和块扫描突变，鉴定出位于-100至-58区域的42 bp片段对JA和激发子响应必需且充分，命名为JERE元件；其中M2-M5位点突变会显著消除响应活性。利用酵母单杂交筛选获得两类AP2结构域转录因子ORCA1和ORCA2，凝胶迁移实验证实ORCA2可直接结合JERE。瞬时共转化显示，ORCA2过表达可使Str启动子活性提高2.9倍，而ORCA1仅提高1.3倍，且ORCA2对M2-M5突变体的激活能力显著降低。表达分析表明，Orca2 mRNA在MeJA处理后30分钟即被强烈诱导并呈双相模式，而Orca1为组成型表达。这些结果揭示了JERE元件和ORCA2转录因子是茉莉酸与激发子信号通路调控Str基因表达的核心环节，为理解植物次生代谢物诱导调控机制提供了重要基础。

创新点

首次鉴定出同时响应JA和激发子的顺式作用元件JERE，并发现编码AP2结构域转录因子ORCA2，证明其通过直接结合JERE激活Str启动子；揭示了GCC-box类似元件在JA信号传导中的作用

研究对象（4）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Catharanthus roseus (长春花) 萜类吲哚生物碱(TIA)生物合成途径 Str (strictosidine synthase) Strictosidine synthase 催化 Str基因编码异胡豆苷合成酶，是TIA生物合成的关键酶，其启动子包含JERE元件
Catharanthus roseus (长春花) 茉莉酸信号转导途径 Orca2 ORCA2 调控 AP2结构域转录因子，响应JA和激发子，通过结合JERE激活Str启动子，分子量24 kDa
Catharanthus roseus (长春花) 茉莉酸信号转导途径 Orca1 ORCA1 调控 AP2结构域转录因子，组成型表达，对Str启动子激活作用弱，可能参与干旱响应，分子量41 kDa
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 无 HIS3 (筛选标记) 无 调控 酵母单杂交筛选中RV四聚体融合HIS3基因作为报告系统

关键发现

  1. Str启动子中42 bp RV区域（-100至-58）对JA和激发子响应必需且充分
  2. 阻断突变M2-M5消除响应，其中M3、M4、M5影响最严重
  3. RV四聚体可赋予报告基因JA和激发子诱导表达，而突变M2-M5四聚体则丧失诱导性
  4. 酵母单杂交筛选获得ORCA1和ORCA2两类AP2结构域蛋白
  5. ORCA2瞬时过表达使Str启动子活性提高2.9倍，ORCA1仅1.3倍
  6. ORCA2与野生型BH启动子及M1、M6突变体强烈激活报告基因，M2-M5突变显著降低激活
  7. Orca2 mRNA在MeJA处理后30分钟即高水平诱导，呈双相模式，在激发子处理后1小时内增加，2小时达峰，8小时出现第二个峰
  8. Orca1表达组成型且不受MeJA或激发子诱导
  9. ORCA2蛋白分子量24 kDa，ORCA1分子量41 kDa。

研究结论

Str启动子中的JERE（含GCC-box样序列）和AP2结构域转录因子ORCA2是茉莉酸和激发子响应表达的关键组分；ORCA2作为JA信号通路下游转录因子直接调控萜类吲哚生物碱生物合成基因Str的表达，而ORCA1可能参与其他胁迫响应。