Microorganism design for heterologous biosynthesis of cannabinoids
- 作者
- Ángela Carvalho, Esben Halkjær Hansen, Oliver Kayser, Simon Carlsen, Felix Stehle
- 单位
- Evolva Biotech A/S, Lersø Parkalle 42-44, 2100, Copenhagen, Denmark; Laboratory of Technical Biochemistry, Department of Biochemical & Chemical Engineering, TU Dortmund University, Emil-Figge-Str. 66, 44227 Dortmund, Germany
- 杂志
- FEMS Yeast Research（2017）
- DOI
- 10.1093/femsyr/fox037
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
目前大麻素主要从受严格监管的大麻植物中提取，存在法规限制、产量低、成本高、稀有大麻素难以获得等问题；化学合成复杂且收率低，生物技术生产是可行的替代方案。
研究策略
基于合成生物学策略，在异源微生物宿主（以酿酒酵母为重点）中重构大麻素生物合成途径。通过代谢工程优化前体供给（增强甲羟戊酸途径以获得GPP、改造脂肪酸合成或导入异源酶以获得己酰-CoA、强化乙酰-CoA池），并表达植物来源的关键酶（OLS、OAC、CBGAS、THCAS等），同时利用蛋白工程（如ERG20^WW）和可溶性异戊烯基转移酶NphB解决膜蛋白表达难题，还引入P450和糖基转移酶实现多样化和改善溶解性。
核心内容
该研究系统提出了利用合成生物学在异源微生物中重构大麻素生物合成途径的策略，以克服从大麻植物提取受法规限制、产量低且稀有大麻素难以获得的瓶颈。研究以酿酒酵母为主要底盘，通过代谢工程强化前体供给：一方面增强甲羟戊酸途径以增加香叶基焦磷酸（GPP）的供应，另一方面通过改造脂肪酸合成或导入异源酶获得己酰辅酶A。同时表达了植物来源的关键酶如橄榄醇合酶、橄榄醇酸环化酶和大麻萜酚酸合酶，并利用蛋白工程手段解决膜蛋白表达难题，包括将法尼基焦磷酸合酶ERG20改造成ERG20-F96W-N127W突变体以选择性生成GPP，以及采用来自链霉菌的可溶性异戊烯基转移酶NphB替代膜结合的CBGAS。结果显示，在毕赤酵母和酿酒酵母中表达THCAS后，通过饲喂CBGA可产生高达360 mg/L的四氢大麻酚酸；在马克斯克鲁维酵母中实现142 mg/L的己酸产量；而过表达甲羟戊酸途径基因可使青蒿二烯产量达到40 g/L。研究还引入P450酶和糖基转移酶以实现大麻素衍生物的多样化并改善其溶解性。该工作表明微生物异源生产主要及稀有药用大麻素在技术上是可行的，为规模化、低成本获取大麻素及相关衍生物提供了可行替代方案。
创新点
系统提出了在微生物中异源生产大麻素的合成生物学策略；通过ERG20突变体（ERG20-F96W-N127W）将法尼基焦磷酸合酶改造为香叶基焦磷酸合酶，提高GPP供给；利用来自链霉菌的可溶性异戊烯基转移酶NphB替代膜结合的CBGAS，改善表达和催化；通过引入P450酶和糖基转移酶等修饰酶，实现大麻素衍生物的多样化并改善其理化性质。
研究对象（16）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 甲羟戊酸途径 (MVA) | ERG20 (ERG20-F96W-N127W) | 法尼基焦磷酸合酶/香叶基焦磷酸合酶 (ERG20蛋白) | 催化 | 突变体主要产生GPP而非FPP，提高GPP供给 |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 甲羟戊酸途径 (MVA) | tHMG1 | 截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 | 催化 | 过表达以解除甲羟戊酸途径限速步骤 |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 甲羟戊酸途径 (MVA) | IDI1 | 异戊烯基焦磷酸异构酶 | 催化 | 催化IPP与DMAPP互变 |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 脂肪酸合成 | ACC1 | 乙酰-CoA羧化酶 | 催化 | 提供脂肪酸合成所需丙二酰-CoA |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 大麻素生物合成 (聚酮途径) | CsHCS1/CsAEE1 | 己酰-CoA合成酶1 | 催化 | 催化己酸生成己酰-CoA |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 大麻素生物合成 (聚酮途径) | OLS | 橄榄醇合酶 | 催化 | 催化己酰-CoA与三分子丙二酰-CoA缩合生成橄榄醇 |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 大麻素生物合成 (聚酮途径) | OAC | 橄榄醇酸环化酶 | 催化 | 催化橄榄醇的C2-C7醛醇环化生成橄榄醇酸 |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 大麻素生物合成 | CBGAS | 大麻萜酚酸合酶 (芳香异戊烯基转移酶) | 催化 | 膜结合酶，催化GPP与OA缩合生成CBGA，活性低且副产物多 |
| 毕赤酵母 (Komagataella phaffii) | 大麻素生物合成 | thcas | 四氢大麻酚酸合酶 (THCAS) | 催化 | 在毕赤酵母中高水平胞内表达，催化CBGA环化为THCA |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 大麻素生物合成 | thcas | 四氢大麻酚酸合酶 (THCAS) | 催化 | 全细胞生物转化CBGA生成THCA，产量达360 mg/L |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 大麻素生物合成 | cbdas | 大麻二酚酸合酶 (CBDAS) | 催化 | 催化CBGA环化为CBDA，表达水平低于THCAS |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 大麻素生物合成 | — | 大麻色烯酸合酶 (CBCAS) | 催化 | 催化CBGA环化为CBCA |
| 链霉菌属/异源宿主 | 大麻素生物合成 (异戊烯基化) | nphB | NphB (可溶性芳香异戊烯基转移酶) | 催化 | 来自Streptomyces sp. CL190，可溶性，接受OA和GPP，可替代CBGAS |
| 酿酒酵母 (平台) | 大麻素衍生物修饰 | UGT76G1 | 糖基转移酶 UGT76G1 | 催化 | 来自甜叶菊，可对大麻素进行糖基化，提高水溶性 |
| 酿酒酵母 (平台) | 大麻素衍生物修饰 | — | 细胞色素P450酶 | 催化 | 可将THC羟基化为11-OH-THC或进一步氧化为THC-COOH |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 甲羟戊酸途径 (MVA) | UPC2-1 | 甾醇调节元件结合蛋白 | 调控 | 上调甲羟戊酸途径基因表达 |
关键发现
- 在Kluyveromyces marxianus中实现了最高142 mg/L的己酸产量
- 在酿酒酵母中过表达全部甲羟戊酸途径基因后amorphadiene产量达到40 g/L
- 在毕赤酵母和酿酒酵母中表达THCAS后，通过饲喂CBGA可产生高达360 mg/L的THCA
- ERG20-F96W-N127W突变体有效生成GPP并抑制FPP合成
- THCAS在毕赤酵母中可高水平胞内积累。
研究结论
利用合成生物学在异源微生物中重构大麻素生物合成途径是可行的，能够生产主要大麻素和稀有衍生物，可为药用大麻素提供可规模化、高质量、成本有效的替代来源，并可通过修饰酶产生新的大麻素衍生物。