Engineering yeast metabolism for production of terpenoids for use as perfume ingredients, pharmaceuticals and biofuels
- 作者
- Yueping Zhang, Jens Nielsen, Zihe Liu
- 单位
- Beijing Advanced Innovation Center for Soft Matter Science and Engineering, Beijing University of Chemical Technology; College of Life Science and Technology, Beijing University of Chemical Technology; Department of Biology and Biological Engineering, Chalmers University of Technology; Novo Nordisk Foundation Center for Biosustainability, Technical University of Denmark
- 杂志
- FEMS Yeast Research（2017）
- DOI
- 10.1093/femsyr/fox080
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
天然萜类化合物主要依赖植物提取和化学合成，存在可持续性差、产率低等问题；如何通过代谢工程改造酵母，实现多种萜类化合物（香料成分、药物、生物燃料）的高效生产。
研究策略
综述了工程酵母生产萜类的多种策略，包括：改造甲羟戊酸途径（过表达tHMG1、Hmg2 K6R突变、Upc2-1等）、下调竞争途径（ERG9）、增强乙酰-CoA供给（xPK-PTA-ADA途径、NADH-HMGr）、平衡辅因子（ZWF1、POS5）、异源表达萜类合酶和P450、利用融合蛋白和蛋白工程（如ERG20突变及融合）、动态调控及原位产物去除等。
核心内容
该文系统综述了通过代谢工程改造酿酒酵母生产萜类化合物的研究进展。围绕萜类天然产物依赖植物提取和化学合成所存在的可持续性差、产率低等核心问题，研究总结了多种策略，包括过表达截短的HMG-CoA还原酶tHMG1或Hmg2 K6R突变体以强化甲羟戊酸途径、下调鲨烯合酶编码基因ERG9以削弱竞争性麦角固醇分支、引入新型乙酰-CoA供给途径（xPK-PTA-ADA）和NADH依赖的HMG-CoA还原酶以改善前体与辅因子供给，以及通过ERG20突变及融合蛋白策略优化异戊烯基二磷酸利用。文中列举了代表性成果：β-法尼烯在工业生物反应器中产量达130 g/L，青蒿酸达25 g/L，均达到工业水平；香叶醇通过ERG20WW-香叶醇合酶融合策略在补料分批发酵中产量达1.69 g/L；松萜借助融合蛋白及HMG2 K6R过表达产量为17.5 mg/L，较对照提高340倍。这些结果表明，通过系统的途径工程与辅因子平衡改造，酵母已成为生产多种萜类的优良平台，未来进一步优化乙酰-CoA供给和克服产物毒性将拓展其工业应用潜力。
创新点
系统总结了近年酵母萜类生产的关键进展，包括新型乙酰-CoA途径（xPK-PTA-ADA）和NADH依赖的HMG-CoA还原酶，以及利用类胡萝卜素作为可视化筛选报告系统等。
研究对象（26）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸途径 | tHMG1 | 截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 | 催化 | N端截短使催化域定位于胞质，过表达显著增加鲨烯产量 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸途径 | HMG2 | HMG-CoA还原酶异构体2 | 催化 | K6R稳定性突变体，过表达使鲨烯产量较野生型提高20倍 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸/麦角固醇途径 | UPC2 | 转录因子Upc2 | 调控 | 组成型激活突变体upc2-1过表达，增强甾醇吸收和MVA基因表达 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸途径 | IDI1 | 异戊烯基二磷酸异构酶 | 催化 | 过表达增强单萜产量 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸途径 | ERG20 | 法尼基二磷酸合酶 | 催化 | K197突变（如K197E）或F96W/N127W双突变增加GPP池；与合酶融合可提高单萜产量 |
| Saccharomyces cerevisiae | 麦角固醇合成 | ERG9 | 鲨烯合酶 | 催化 | 下调以减少与靶向萜类竞争FPP，需条件性调控（如MET3或HXT1启动子） |
| Saccharomyces cerevisiae | 乙酰-CoA代谢 | ADA/xPK/PTA | 乙酰醛脱氢酶（酰化）/磷酸酮醇酶/磷酸转乙酰酶 | 催化 | 异源途径替代PDH支路，增加胞质乙酰-CoA并降低ATP消耗，用于β-法尼烯生产 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸途径 | NADH-HMGr | NADH特异性HMG-CoA还原酶 | 催化 | 与xPK-PTA-ADA联用，平衡NADH/NADPH，降低氧需求75%用于β-法尼烯生产 |
| Saccharomyces cerevisiae | 磷酸戊糖途径 | ZWF1 | 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 | 催化 | 过表达使番茄红素产量提高1.6倍，β-胡萝卜素提高1.2倍 |
| Saccharomyces cerevisiae | NADPH代谢 | POS5 | 线粒体NADH激酶 | 催化 | 过表达使番茄红素和β-胡萝卜素产量分别提高1.9和1.6倍 |
| Saccharomyces cerevisiae | 单萜生物合成 | AaLS1 | (S)-芳樟醇合酶（来自猕猴桃） | 催化 | 与ERG20 K197E融合，产量提高1.7倍 |
| Saccharomyces cerevisiae | 单萜生物合成 | tVoGES | 截短香叶醇合酶（来自缬草） | 催化 | 与ERG20WW融合，补料分批发酵香叶醇达1.69 g/L |
| Saccharomyces cerevisiae | 单萜生物合成 | sabinene synthase | 松萜合酶（来自Salvia pomifera） | 催化 | 与ERG20WW融合，HMG2 K6R背景下产量17.5 mg/L，提高340倍 |
| Saccharomyces cerevisiae | 倍半萜生物合成 | ADS | 紫穗槐-4,11-二烯合酶 | 催化 | 过表达并结合MVA工程，紫穗槐二烯产量>40 g/L；青蒿酸生产关键酶 |
| Saccharomyces cerevisiae | 倍半萜生物合成 | CYP71AV1 | 细胞色素P450单加氧酶（来自青蒿） | 催化 | 催化紫穗槐二烯氧化为青蒿酸，结合CPR1和CYB5，青蒿酸产量达25 g/L |
| Saccharomyces cerevisiae | P450催化 | CPR1 | 细胞色素P450还原酶 | 能量供给 | 提供还原当量，辅助P450催化 |
| Saccharomyces cerevisiae | P450催化 | CYB5 | 细胞色素b5 | 能量供给 | 细胞色素b5，辅助P450电子传递 |
| Saccharomyces cerevisiae | 二萜生物合成 | BTS1 | 香叶基香叶基二磷酸合酶 | 催化 | 与ERG20融合蛋白增强GGPP供给，用于二萜和类胡萝卜素生产 |
| Saccharomyces cerevisiae | 类胡萝卜素合成 | crtE | GGPP合酶（来自X. dendrorhous） | 催化 | 额外表达使β-胡萝卜素达5.9 mg/g DCW |
| Saccharomyces cerevisiae | 类胡萝卜素合成 | crtYB/crtI | 双功能番茄红素环化酶/八氢番茄红素合酶；八氢番茄红素脱氢酶（来自X. dendrorhous） | 催化 | 在酵母中构建β-胡萝卜素合成途径 |
| Saccharomyces cerevisiae | 三萜生物合成 | SSL1-SSL3 | 鲨烯合酶样蛋白（来自Botryococcus braunii） | 催化 | 在ERG9敲除菌株中表达，生产botryococcene 70 mg/L |
| Saccharomyces cerevisiae | 甾体合成 | CYP11A1/CYP11B1/CYP17A1/CYP21A1/3β-HSD | 哺乳动物P450及羟基类固醇脱氢酶 | 催化 | 重定向内源甾醇途径，全合成氢化可的松 |
| Saccharomyces cerevisiae | 乙酰-CoA转运 | CTP1 | 线粒体柠檬酸转运蛋白 | 转运 | 过表达增强柠檬酸从线粒体到胞质的转运，用于ACL途径提高乙酰-CoA |
| Saccharomyces cerevisiae | 丙酮酸脱氢酶复合体 | PDH complex (cytosolic) | 细菌丙酮酸脱氢酶复合体 | 催化 | 胞质表达可替代PDH支路，但尚未用于萜类生产 |
| Saccharomyces cerevisiae | 乙酰-CoA代谢 | ACL/MDH3/ME | ATP:柠檬酸裂解酶、苹果酸脱氢酶、苹果酸酶 | 催化 | ACL途径用于增加乙酰-CoA，已在脂肪酸生产中验证，尚未用于萜类 |
| Saccharomyces cerevisiae | 木糖利用 | XR/XDH or XI | 木糖还原酶/木糖醇脱氢酶或木糖异构酶 | 催化 | 用于利用木质纤维素水解液中的木糖 |
关键发现
- β-法尼烯在工业生物反应器中产量达到130 g/L（Meadows et al. 2016）
- 紫穗槐二烯产量达40 g/L（Westfall et al. 2012）
- 青蒿酸在生物反应器中产量达25 g/L（Paddon et al. 2013）
- 香叶醇通过ERG20WW-tVoGES融合蛋白策略在补料分批发酵中产量达1.69 g/L（Zhao et al. 2017）
- 松萜（sabinene）通过ERG20WW-松萜合酶融合蛋白及HMG2 K6R过表达产量达17.5 mg/L，较对照提高340倍（Ignea et al. 2014）
- 过表达ZWF1使番茄红素产量提高1.6倍、β-胡萝卜素提高1.2倍，过表达POS5分别提高1.9倍和1.6倍（Zhao, Shi and Zhan 2015）
- 通过酵母缺失文库筛选，rox1、yil064w、ypl062w缺失可提高bisabolene产量约2倍（Ozaydin et al. 2013）
- β-胡萝卜素产量达5.9 mg/g DCW（Verwaal et al. 2007）
- 番茄红素在补料分批发酵中达55.56 mg/g DCW（Chen et al. 2016）
- 二萜milthiradiene产量488 mg/L（Dai et al. 2012），香叶基香叶醇3.31 g/L（Tokuhiro et al. 2009）
- 三萜botryococcene产量70 mg/L（Niehaus et al. 2011）。
研究结论
通过系统的代谢工程改造，酵母已能够高效生产多种萜类化合物，如β-法尼烯和青蒿酸等已达到工业水平；未来通过优化乙酰-CoA供给、辅因子平衡、底物利用（如木糖）及克服产物毒性，酵母将成为萜类化合物生物合成的优良平台。