Corn stover variability drives differences in bisabolene production by engineered Rhodotorula toruloides
- 作者
- Onyinye Okonkwo, Chang Dou, Ethan Oksen, Akash Narani, Wilian Marcondes, Xiaowen Chen, Joonhoon Kim, Yuqian Gao, Meagan C. Burnet, Bobbie-Jo M. Webb-Robertson, Brenton C. Poirier, Deepti Tanjore, Jon K. Magnuson, Nathalie Munoz Munoz, James Gardner
- 单位
- Advanced Biofuels and Bioproducts Process Development Unit, Lawrence Berkeley National Lab, Berkeley, CA 94608, USA; National Biology Center, National Renewable Energy Lab, 1617 Cole Blvd., Golden, CO 80401, USA; Energy and Environment Directorate, Pacific Northwest National Laboratory, Richland, WA 99352, USA; US Department of Energy Agile BioFoundry, Emeryville, CA 94608, USA; US Department of Energy Joint BioEnergy Institute, Emeryville, CA 94608, USA; Earth and Biological Sciences Directorate, Pacific Northwest National Laboratory, Richland, WA 99354, USA
- 杂志
- Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology（2024）
- DOI
- 10.1093/jimb/kuae034
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
玉米秸秆原料的异质性（不同批次、解剖部位差异、储存自热导致的生物降解）如何影响工程化红冬孢酵母（Rhodotorula toruloides）利用 DMR-EH 水解液生产双酚烯（bisabolene）的效率。
研究策略
将不同来源的玉米秸秆（全秆不同批次、解剖部位（cob、husk、stalk）和不同程度自热储存样品）经 DMR-EH（脱乙酰化、机械精制、酶解）处理获得水解液；使用工程化 R. toruloides 在 Ambr250 高通量生物反应器中发酵产双酚烯；通过 HPLC、GC-MS 测定糖消耗与产物滴度，ICP-OES 分析金属元素组成，并结合全局蛋白质组学分析从分子层面解释原料异质性对发酵性能的影响。
核心内容
该研究系统考察了玉米秸秆原料异质性对工程化红冬孢酵母利用DMR-EH水解液生产双酚烯的影响，涵盖批次差异、解剖部位和储存自热程度三类变量。通过Ambr250高通量生物反应器发酵，结合HPLC、ICP-OES和全局蛋白质组学分析，从分子层面解析了原料差异导致发酵性能不同的机制。结果显示，解剖部位中stalk水解液产量最高，双酚烯达8.89 g/L，显著高于whole stover的5.68 g/L和husk的1.80 g/L；严重自热原料产量（2.69 g/L）明显高于轻度（1.38 g/L）和中度自热（1.38 g/L），提示自热可改善酶可及性。蛋白质组学共鉴定4218个蛋白，发现金属转运蛋白、铁硫簇蛋白和能量代谢蛋白的差异表达是关键因素，其中Feedstock 3的铁浓度（1.98 mM）约为Feedstock 4的4倍，对应铁转运蛋白显著上调。该研究揭示了原料异质性通过金属元素平衡和能量代谢影响双酚烯合成效率的机制，为工业规模生物转化中原料选择与预处理策略优化提供了理论依据。
创新点
系统考察了玉米秸秆多种异质性来源（批次、解剖部位、储存自热）对双酚烯发酵的影响；将全局蛋白质组学与原料金属元素（尤其铁）分析相结合，揭示了金属转运蛋白、铁硫簇蛋白和能量代谢蛋白的差异表达与发酵性能的关系；发现严重自热玉米秸秆水解液反而提升发酵性能，提示储存自热可改善酶可及性。
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Rhodotorula toruloides | 双酚烯生物合成（萜烯途径） | — | — | 催化 | 工程化菌株（GB 2.0 衍生，来自 Sandia National Laboratories）将糖转化为双酚烯 |
| Rhodotorula toruloides | 甲羟戊酸途径 | — | — | 催化 | 为双酚烯合成提供异戊二烯前体 |
| Rhodotorula toruloides | β-氧化 | — | acyl-CoA synthetase | 催化 | 催化脂肪酸活化为 acyl-CoA，在 stalk 水解液发酵中显著上调 |
| Rhodotorula toruloides | β-氧化 | — | hydroxyacyl-CoA dehydrogenase | 催化 | 脂肪酸 β-氧化途径酶，参与生成乙酰-CoA |
| Rhodotorula toruloides | β-氧化 | — | enoyl-CoA hydratase | 催化 | 脂肪酸 β-氧化途径酶 |
| Rhodotorula toruloides | 金属离子转运 | — | iron transporters | 转运 | 在 Feedstock 3 中表达高于 Feedstock 4，与铁浓度（1.98 vs 0.31 mM）差异一致 |
| Rhodotorula toruloides | 金属离子转运 | — | protective metal ion antiporter | 转运 | 在高铁 Feedstock 1、2、3 中上调 |
| Rhodotorula toruloides | 金属离子转运 | — | copper and zinc transporters | 转运 | 在 Feedstock 4 与 Feedstock 3 之间差异表达 |
| Rhodotorula toruloides | 能量代谢 | — | iron-sulfur cluster proteins | 能量供给 | 在 stalk 水解液发酵中下调，与铁的可用性相关，提示代谢平衡的协调响应 |
| — | 纤维素/半纤维素水解 | — | CTEC-3 / HTEC-3 | 催化 | DMR-EH 预处理中分别释放纤维素和半纤维素糖 |
关键发现
- ['全玉米秸秆 4 个批次（Feedstock 1–4）的双酚烯滴度分别为
- 14±0.6、2.77±0.19、2.44±0.3、2.37±0.06 g/L，初始葡萄糖分别为
- 4±2.3、101.3±5.0、75.4±2.34、58.9±5.9 g/L，糖消耗速率有差异但终产量无显著差异。', '解剖部位中 stalk 水解液产量最高，双酚烯达
- 89±0.47 g/L，其次为 whole stover
- 68±0.51 g/L，cob
- 61±0.59 g/L，husk
- 80±0.09 g/L；stalk 的葡萄糖和木糖在 48 h 内完全消耗，husk 仅消耗
- 9% 葡萄糖和
- 4% 木糖。', '严重自热（severe）玉米秸秆水解液的双酚烯产量为
- 69±0.12 g/L，显著高于轻度自热（1.38±0.24 g/L）和中度自热（1.38±0.08 g/L）；轻度自热水解液糖浓度最高（葡萄糖
- 6 g/L、木糖
- 5 g/L），但发酵消耗最慢。', 'ICP-OES 显示 Feedstock 3 的铁浓度为
- 98 mM，约为 Feedstock 4（0.31 mM）的 4 倍，对应铁转运蛋白在 Feedstock 3 中显著上调。', 'stalk 水解液发酵中铁硫簇相关蛋白及无机离子转运/代谢蛋白下调，且 stalk 中镁浓度约为 cob/husk 的 2 倍、磷浓度高
- 2 倍，提示金属元素平衡影响代谢。', '严重自热玉米秸秆经一阶段与两阶段 DMR-EH 预处理后双酚烯产量无显著差异（p=0.99），但一阶段预处理底物消耗更快。', '蛋白质组学共鉴定 62,685 个肽段，过滤后 40,970 个，映射到 4,218 个蛋白；不同水解液之间蛋白质表达差异显著，集中于金属转运、能量产生与转化、脂质代谢与转运等功能类别。']
研究结论
DMR-EH 预处理对所有测试的玉米秸秆原料均有效，R. toruloides 均能产双酚烯。但原料异质性（批次、解剖部位、自热程度）显著影响糖消耗、菌体生长和产物滴度，其中解剖部位中 stalk 产量最高（8.89 g/L），严重自热原料产量高于轻度和中度自热。蛋白质组学显示金属离子（特别是铁）转运及能量代谢相关蛋白的差异表达是造成发酵差异的重要因素。理解并针对性地调控原料异质性有助于提高工业规模生物转化的经济性和稳定性。