Acyclic carotenoid and cyclic apocarotenoid cleavage by an orthologue of lignostilbene-α,β-dioxygenase in Rhodopseudomonas palustris
- 作者
- Isamu Maeda, Atsushi Inaba, Hiroyuki Koike, Koichi Yoneyama, Shunsaku Ueda, Kazuyuki Yoshida
- 单位
- Department of Applied Biochemistry, Faculty of Agriculture, Utsunomiya University; Weed Science Center, Utsunomiya University
- 杂志
- Journal of Biochemistry（2013）
- DOI
- 10.1093/jb/mvt075
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
揭示Rhodopseudomonas palustris中一个推定木质素二苯乙烯-α,β-双加氧酶同源基因（ORF RPA1208）是否编码功能性类胡萝卜素裂解加氧酶，并明确其底物特异性和裂解位点
研究策略
通过系统发育分析将该酶归入细菌木质素二苯乙烯-α,β-双加氧酶家族；在重组大肠杆菌中分别构建番茄红素/神经孢烯合成途径并共表达RPA1208，分析体内代谢产物；制备含重组蛋白的细胞裂解液，以all-trans-β-apo-8'-carotenal为底物进行体外酶活测定，利用HPLC和GC-MS鉴定产物
核心内容
该研究鉴定并表征了沼泽红假单胞菌中推定木质素二苯乙烯-α,β-双加氧酶同源基因RPA1208编码的酶（RpsCCO）的类胡萝卜素裂解功能。系统发育分析将其归入细菌木质素二苯乙烯-α,β-双加氧酶家族，与大豆慢生根瘤菌Blr5790同源性最高（73%）。在重组大肠杆菌中共表达番茄红素或神经孢烯合成途径与RpsCCO，菌落出现漂白，HPLC检测到λmax=395 nm产物，经GC-MS鉴定为γ-视醛（m/z=284），证实其催化15,15'双键裂解。体外酶活实验以all-trans-β-apo-8'-carotenal为底物，产物为α-视醛和apo-8',15'-胡萝卜素二醛（m/z=164），1.0 mM Fe²⁺可加速反应，但未检测到对β-胡萝卜素的裂解活性。RpsCCO是此类同源物中首个被证实兼具无环类胡萝卜素（番茄红素、神经孢烯）与环状脱辅基类胡萝卜素裂解活性的酶，提示其在细菌类胡萝卜素代谢中可能参与视黄醛类产物的生成，拓展了对微生物类胡萝卜素裂解酶功能多样性的认识。
创新点
首次证明类胡萝卜素光养细菌中木质素二苯乙烯-α,β-双加氧酶同源物RpsCCO对无环类胡萝卜素（番茄红素、神经孢烯）和环状脱辅基类胡萝卜素（β-apo-8'-carotenal）均具有15,15'双键裂解活性，可生成视黄醛类产物；该酶是此类同源物中第一个被证实具有类胡萝卜素裂解功能的酶
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Rhodopseudomonas palustris CGA009 | 类胡萝卜素裂解 | RPA1208 | RpsCCO | 催化 | 天然宿主中的推定类胡萝卜素裂解加氧酶，催化15,15'双键裂解 |
| Escherichia coli JM109 / BL21(DE3) | 类胡萝卜素裂解 | RPA1208 | RpsCCO | 催化 | 异源表达重组RpsCCO，用于体内及体外功能验证 |
| Escherichia coli JM109 | 番茄红素生物合成 | crtE | CrtE | 催化 | 来自Erwinia uredovora，牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶 |
| Escherichia coli JM109 | 番茄红素生物合成 | crtB | CrtB | 催化 | 来自Erwinia uredovora，八氢番茄红素合成酶 |
| Escherichia coli JM109 | 番茄红素生物合成 | crtI | CrtI | 催化 | 来自Pantoea agglomerans，八氢番茄红素脱氢酶，用于合成番茄红素或神经孢烯 |
关键发现
- RpsCCO与B. japonicum USDA 110的推定木质素二苯乙烯-α,β-双加氧酶（Blr5790）氨基酸序列同一性最高（73%）
- 在产番茄红素大肠杆菌中表达RpsCCO导致菌落漂白，HPLC检测到吸收峰λmax=395 nm，GC-MS分子离子m/z=284，鉴定为γ-视黄醛（15,15'裂解产物）
- 在产神经孢烯菌株中检测到λmax=370 nm的产物，推测为(2E,4E,6E,10E)-3,7,11,15-四甲基十六碳-2,4,6,10,14-五烯醛（神经孢烯15,15'裂解产物）
- 体外实验显示重组酶裂解all-trans-β-apo-8'-carotenal生成α-视黄醛（m/z=284）和apo-8',15'-apocarotenedial（m/z=164），且1.0 mM Fe2+可加速反应
- 未检测到对β-胡萝卜素的裂解活性
研究结论
RpsCCO是细菌木质素二苯乙烯-α,β-双加氧酶同源物中第一个被表征的类胡萝卜素裂解加氧酶，特异性催化15,15'双键氧化裂解，既能裂解无环类胡萝卜素（番茄红素、神经孢烯）也能裂解环状脱辅基类胡萝卜素（β-apo-8'-carotenal），生成相应的视黄醛类产物