Transcription factor CitERF71 activates the terpene synthase gene CitTPS16 involved in the synthesis of E-geraniol in sweet orange fruit
- 作者
- Xiang Li, Yaying Xu, Shuling Shen, Xueren Yin, Harry Klee, Bo Zhang, Kunsong Chen
- 单位
- Laboratory of Fruit Quality Biology/Zhejiang Provincial Key Laboratory of Horticultural Plant Integrative Biology, Zhejiang University, Zijingang Campus, Hangzhou 310058, PR China; Horticultural Sciences, Plant Innovation Center, Genetics Institute, University of Florida, Gainesville, FL 32611, USA
- 杂志
- Journal of Experimental Botany（2017）
- DOI
- 10.1093/jxb/erx316
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
甜橙果实中重要的挥发性单萜E-香叶醇的合成酶未被鉴定，其转录调控机制也未知。
研究策略
通过基因组筛选和序列同源性克隆候选TPS基因，体外酶活验证和果实/叶片瞬时过表达鉴定功能；利用转录组表达相关性分析筛选调控转录因子，并采用双荧光素酶、酵母单杂交和EMSA验证其直接结合启动子并激活转录。
核心内容
甜橙果实中重要的挥发性单萜E-香叶醇的合成酶及其转录调控机制此前尚不明确。本研究通过同源克隆从甜橙基因组中鉴定了萜烯合酶基因CitTPS16，体外酶活实验证实重组CitTPS16以GPP为底物催化生成E-geraniol，占总产物87.07%。在Newhall甜橙果实果皮和叶片中瞬时过表达CitTPS16后，E-geraniol含量分别从4.42 μg g⁻¹提升至6.85 μg g⁻¹、从78.50 μg g⁻¹提升至111.32 μg g⁻¹，均显著增加。通过转录组表达相关性分析筛选到转录因子CitERF71，两者在果实发育中表达呈正相关（R²=0.624）。双荧光素酶、酵母单杂交和EMSA实验证明CitERF71直接结合CitTPS16启动子上的ACCCGCC和GGCGGG基序并激活其转录，使启动子活性诱导约25倍。启动子5′缺失分析进一步确认了关键调控区域。该研究首次鉴定了甜橙中合成E-香叶醇的萜烯合酶，并揭示了CitERF71通过直接结合GCC-like基序调控该基因表达的分子机制，为柑橘果实香气品质的代谢工程改良提供了重要靶点。
创新点
首次鉴定甜橙中负责E-香叶醇合成的萜烯合酶CitTPS16；发现转录因子CitERF71通过直接结合CitTPS16启动子上的ACCCGCC和GGCGGG基序激活其表达，从而调控E-香叶醇合成。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS | 单萜生物合成 | CitTPS16 | CitTPS16 | 催化 | 体外酶活验证，以GPP为底物合成E-geraniol、linalool和limonene |
| Citrus sinensis (Newhall甜橙) | 单萜生物合成 | CitTPS16 | CitTPS16 | 催化 | 果实果皮和叶片瞬时过表达，E-geraniol含量显著增加 |
| Nicotiana benthamiana | 转录调控 | CitERF71 | CitERF71 | 调控 | 双荧光素酶实验证明激活CitTPS16启动子（约25倍） |
| Saccharomyces cerevisiae Y1HGold | 转录调控 | CitERF71 | CitERF71 | 调控 | 酵母单杂交验证直接结合CitTPS16启动子 |
| Escherichia coli Rosetta (DE3) pLysS | 转录调控 | CitERF71 | CitERF71 | 调控 | 表达重组蛋白用于EMSA，证明结合ACCCGCC和GGCGGG基序 |
关键发现
- 重组CitTPS16以GPP为底物催化生成E-geraniol（占总产物87.07%，另有linalool
- 11%、limonene
- 81%）；在Newhall甜橙果实果皮和叶片中瞬时过表达CitTPS16，E-geraniol含量分别从4.42 μg g^-1增至6.85 μg g^-1、从78.50 μg g^-1增至111.32 μg g^-1（P<0.05）；CitTPS16与CitERF71在果实发育中表达正相关（R^2=0.624）；双荧光素酶实验中CitERF71使CitTPS16启动子活性诱导约25倍；启动子5'缺失分析显示P1（-1185~0）和P2（-832~0）活性分别降至36.85%和9.85%；EMSA证明CitERF71特异性结合ACCCGCC和GGCGGG基序，突变核心序列后结合消失。
研究结论
本研究鉴定出甜橙中合成E-香叶醇的萜烯合酶CitTPS16，并证明转录因子CitERF71直接结合其启动子中的GCC-like基序激活该基因表达，该调控机制在甜橙果实E-香叶醇合成中发挥重要作用。