Heteromeric and Homomeric Geranyl Diphosphate Synthases from Catharanthus roseus and Their Role in Monoterpene Indole Alkaloid Biosynthesis
- 作者
- Avanish Rai, Shachi S. Smita, Anup Kumar Singh, Karuna Shanker, Dinesh A. Nagegowda
- 单位
- CSIR-Central Institute of Medicinal and Aromatic Plants Research Centre, Bangalore, 560065, India; CSIR-Central Institute of Medicinal and Aromatic Plants, Lucknow, 226015, India
- 杂志
- Molecular Plant（2013）
- DOI
- 10.1093/mp/sst058
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
长春花（Catharanthus roseus）中 GPP 合酶（GPPS）的类型及其在单萜吲哚生物碱（MIA）生物合成中的调控作用尚不清楚。
研究策略
从长春花中分离并克隆三个 GPPS 基因（CrGPPS.LSU、CrGPPS.SSU、CrGPPS），在大肠杆菌中异源表达并进行生化表征；通过 qRT-PCR 分析组织、发育阶段及 MeJA 诱导下的表达模式；通过 GFP 融合在拟南芥原生质体中确定亚细胞定位；在长春花叶片中瞬时过表达 AmGPPS.SSU 验证其对 MIA 积累的影响。
核心内容
该研究从长春花中克隆并表征了三个香叶基二磷酸（GPP）合酶基因CrGPPS.LSU、CrGPPS.SSU和CrGPPS。体外生化实验表明，CrGPPS.LSU单独表达时兼具GPP和GGPP合酶活性，产物比例约2:1；CrGPPS.SSU无催化活性，但与CrGPPS.LSU共表达形成异源二聚体后专一产生GPP；CrGPPS同源二聚体只能合成GPP，遗传互补实验证实其不具备体内GGPP合酶功能。亚细胞定位显示CrGPPS.SSU定位于叶绿体，而CrGPPS定位于线粒体，这是植物同源二聚体GPPS线粒体定位的首次报道。表达分析发现CrGPPS.SSU在花中高表达且受茉莉酸甲酯显著双峰诱导，而CrGPPS.LSU与CrGPPS表达相对稳定。在长春花叶片中瞬时过表达SSU同源基因AmGPPS.SSU可使vindoline含量较对照提高45%。这些结果揭示了长春花中异源二聚体与同源二聚体GPPS分工协作的调控机制，确认CrGPPS.SSU是MIA生物合成通量调控的关键节点，为通过调控SSU亚基增强单萜前体供给提供了策略。
创新点
首次在同一植物中同时表征异源二聚体和同源二聚体 GPPS；发现 CrGPPS.LSU 是双功能 G(G)PP 合酶（产生 GPP 和 GGPP），而非纯 GGPPS；鉴定了 CrGPPS.SSU 作为调控亚基在 MIA 生物合成中的关键作用；首次报道了植物同源二聚体 GPPS 的线粒体定位。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 萜类（GPP/GGPP）合成 | CrGPPS.LSU | CrGPPS.LSU | 催化 | 双功能 G(G)PP 合酶，单独产生 GPP 和 GGPP（约2:1）；与 CrGPPS.SSU 互作后专一产生 GPP |
| Escherichia coli | 单萜吲哚生物碱（MIA）生物合成 | CrGPPS.SSU | CrGPPS.SSU | 调控 | 无催化活性的小亚基；与 CrGPPS.LSU 形成异源二聚体，调控链长特异性；MeJA 诱导其表达 |
| Escherichia coli | 萜类（GPP 合成） | CrGPPS | CrGPPS | 催化 | 同源二聚体 GPP 合酶，仅产生 GPP；线粒体定位，可能参与线粒体泛醌等异戊二烯生物合成 |
| 拟南芥原生质体 | — | CrGPPS.SSU | CrGPPS.SSU-GFP | 区室化 | GFP 融合显示定位于叶绿体 |
| 拟南芥原生质体 | — | CrGPPS | CrGPPS-GFP | 区室化 | GFP 融合显示定位于线粒体 |
| 长春花叶片 | MIA 生物合成 | AmGPPS.SSU | AmGPPS.SSU | 调控 | 瞬时过表达与内源 CrGPPS.LSU 互作，使 vindoline 含量提高约45% |
关键发现
- CrGPPS.LSU 单独表达产生 GPP 和 GGPP，比例约 2:1
- CrGPPS.SSU 无催化活性，与 CrGPPS.LSU 共表达形成异源二聚体后专一产生 GPP
- CrGPPS 同源二聚体以 IPP/DMAPP 为底物时只产生 GPP，在 GPP/FPP 存在下可产生微量 GGPP，但体内遗传互补实验证实其无 GGPP 合酶活性
- CrGPPS.SSU 定位于叶绿体，CrGPPS 定位于线粒体
- CrGPPS.LSU 在茎和叶中表达最高，CrGPPS.SSU 在花中最高，CrGPPS 在各组织中组成型表达
- 叶片发育中 CrGPPS.SSU 表达在第五对叶达峰后略降，CrGPPS.LSU 在老叶中高，CrGPPS 在幼叶中高
- MeJA 处理仅显著诱导 CrGPPS.SSU 表达，呈双峰诱导（1h 和 12h 升高），CrGPPS.LSU 和 CrGPPS 相对不变
- 在长春花叶片中瞬时过表达 AmGPPS.SSU 使 vindoline 含量比对照增加 45%。
研究结论
长春花同时具有异源二聚体和同源二聚体 GPPS；CrGPPS.SSU 通过与 CrGPPS.LSU 形成异源二聚体调控 GPP 通量，是 MIA 生物合成的关键调控点；CrGPPS.LSU 单独可提供 GPP 和 GGPP 用于初级代谢，而 CrGPPS 可能参与线粒体类异戊二烯生物合成；通过调控 SSU 表达可增强 MIA 前体供给。