Effects of Random Mutagenesis in a Putative Substrate-Binding Domain of Geranylgeranyl Diphosphate Synthase upon Intermediate Formation and Substrate Specificity
- 作者
- Shin-ichi Ohnuma, Hisashi Hemmi, Chikara Ohto, Hiroyuki Nakane, Tokuzo Nishino
- 单位
- Department of Biochemistry and Engineering, Tohoku University; Bio Research Lab., Toyota Motor Corporation
- 杂志
- Journal of Biochemistry（1997）
- DOI
- 10.1093/oxfordjournals.jbchem.a021642
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析古菌Sulfolobus acidocaldarius GGPP合酶中假定的底物结合域（区域I和II）对中间产物形成和底物特异性的影响
研究策略
对GGPP合酶基因的两个近端区域（I和II）进行区域定向随机突变，构建突变体文库，结合体内红-白筛选、体外酶活测定、产物TLC分析和动力学参数测定，解析突变效应
核心内容
该研究对来自嗜酸热硫化叶菌的香叶基香叶基焦磷酸（GGPP）合酶中假定的底物结合域（区域I和II）进行区域定向随机突变，以解析该区域对中间产物形成和底物特异性的影响。通过构建突变体文库，结合体内番茄红素红-白筛选、体外酶活测定、产物薄层色谱分析及动力学参数测定，发现区域I（氨基酸170-173）同时参与异戊烯基焦磷酸（IPP）和烯丙基底物的识别，而区域II（166-168）对催化无显著影响。野生型酶比活力为3.15 nmol·min⁻¹·mg⁻¹，突变体I-8的IPP米氏常数升至5.99 μM，较野生型0.361 μM升高约17倍，且其以香叶基焦磷酸为底物时GGPP形成活性仅为野生型的约1%。区域I突变导致低IPP浓度下中间产物法尼基焦磷酸和香叶基焦磷酸大量积累，且高浓度烯丙基底物可促进中间产物释放。结果表明，区域I是底物识别与缩合效率的关键决定簇，其突变通过增大IPP米氏常数降低缩合效率并促进中间产物释放，为理解GGPP合酶的底物特异性机制提供了直接证据。
创新点
通过随机突变发现区域I（氨基酸170-173）同时参与IPP和烯丙基底物的识别，该区域突变导致IPP的Km显著升高和中间产物释放增加，而区域II（166-168）无此作用
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli DH5α | 类异戊二烯生物合成（GGPP合成与番茄红素合成） | S. acidocaldarius geranylgeranyl diphosphate synthase gene | geranylgeranyl diphosphate synthase (GGPP synthase) | 催化 | 对区域I（aa170-173）和区域II（aa166-168）进行随机突变，研究中间产物形成和底物特异性 |
| Escherichia coli DH5α | 类异戊二烯生物合成（番茄红素合成） | crtB, crtI | phytoene synthase (CrtB), phytoene desaturase (CrtI) | 催化 | 来自pACYC-IB质粒，用于体内红-白筛选GGPP合酶活性 |
关键发现
- 野生型GGPP合酶比活力为3.15 nmol·min^-1·mg^-1
- 突变体I-8、I-28、I-40的IPP Km分别为5.99、5.57、2.58 μM，而野生型为0.361 μM（I-8升高约17倍）
- 突变体对DMAPP的Km也升高（I-8为17.7 μM vs 野生型6.51 μM），Vmax下降
- 区域I突变株在低IPP浓度下产生大量中间产物FPP和GPP，如以GPP为底物时I-8的GGPP形成活性仅为野生型的约1%
- 产物分布受IPP和烯丙基底物浓度影响，高浓度的烯丙基底物促进中间产物释放
- 区域II突变对催化活性和产物分布无显著影响
- 体内红-白筛选中所有区域I突变体仍能形成红色菌落，说明体内GGPP供给足以支持番茄红素合成
研究结论
区域I（170-173）是GGPP合酶识别IPP和烯丙基底物的关键区域，其突变通过增大Km(IPP)降低缩合效率并促进中间产物释放；区域II在催化中不重要