Identification of Genes Affecting Lycopene Formation in Escherichia coli Transformed with Carotenoid Biosynthetic Genes: Candidates for Early Genes in Isoprenoid Biosynthesis
- 作者
- Hisashi Hemmi, Shin-ichi Ohnuma, Kuniaki Nagaoka, Tokuzo Nishino
- 单位
- Department of Biochemistry and Engineering, Tohoku University, Aoba Aramaki 07, Aoba-ku, Sendai 980-8579
- 杂志
- Journal of Biochemistry（1998）
- DOI
- 10.1093/oxfordjournals.jbchem.a022047
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
大肠杆菌中异戊烯基二磷酸（IPP）生物合成途径的基因和酶尚未鉴定，需寻找参与早期异戊二烯生物合成的基因。
研究策略
构建人工红白筛选系统：将三个类胡萝卜素合成基因 crtE、crtB、crtI 导入大肠杆菌，使野生型形成红色菌落（产生番茄红素）；用 EMS 诱变后筛选失去红色的白色突变株，再通过基因组文库互补恢复红色，从而克隆相关基因。
核心内容
该研究构建了一种基于外源类胡萝卜素合成基因的人工红白筛选系统，用于鉴定大肠杆菌中参与早期异戊二烯生物合成的基因。将crtE、crtB、crtI导入大肠杆菌，使野生型菌株因产生番茄红素而呈现红色菌落；经EMS诱变后筛选失去红色的白色突变株，再通过基因组文库互补恢复红色，从而克隆相关基因。从约21,000个转化子中分离出117个白色突变株，获得29个互补质粒。野生型番茄红素产量为76.9 μg/g干重，突变体降至10.1–70.2 μg/g；互补质粒可使突变体番茄红素产量提高229%–493%。在野生型中导入互补基因也能将产量提升至79.4–87.9 μg/g。互补基因包括IPP异构酶、ATP合酶亚基、三羧酸循环酶、醛脱氢酶及两个未知基因elb1和elb2。多数互补基因通过能量供给、醛类解毒等间接途径影响番茄红素形成，而elb1和elb2可能直接参与早期异戊二烯生物合成，且具有工业应用潜力。
创新点
首次利用外源类胡萝卜素生物合成基因作为人工表型标记，建立高效筛选大肠杆菌早期异戊二烯生物合成缺陷突变体及其互补基因的系统。
研究对象（16）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli DH5α | 类胡萝卜素生物合成（番茄红素） | crtE | 香叶基香叶基二磷酸合酶 | 催化 | 来自欧文氏菌（Erwinia uredovora），催化IPP/FPP生成GGPP |
| Escherichia coli DH5α | 类胡萝卜素生物合成（番茄红素） | crtB | 八氢番茄红素合酶 | 催化 | 来自欧文氏菌，催化两分子GGPP生成八氢番茄红素 |
| Escherichia coli DH5α | 类胡萝卜素生物合成（番茄红素） | crtI | 八氢番茄红素脱氢酶 | 催化 | 来自欧文氏菌，催化八氢番茄红素脱氢生成番茄红素 |
| Escherichia coli DH5α | 异戊二烯生物合成 | idi (o182) | 异戊烯基二磷酸异构酶 | 催化 | 催化IPP与DMAPP互变；p3-47-11/p3-47-13中的互补基因为idi |
| Escherichia coli DH5α | 能量代谢/ATP合成 | uncG, uncD, uncC, uncE, uncF, uncH, uncA | ATP合酶亚基 | 能量供给 | 互补质粒位于84.3–84.5 min，含ATP合酶亚基编码基因，表明ATP对番茄红素形成重要 |
| Escherichia coli DH5α | 三羧酸循环 | gltA | 柠檬酸合酶 | 催化 | 互补突变体3-20和3-23 |
| Escherichia coli DH5α | 三羧酸循环 | sucA | 2-氧戊二酸脱氢酶 | 催化 | 互补突变体3-21 |
| Escherichia coli DH5α | 三羧酸循环 | sucB | 二氢硫辛酰胺琥珀酰转移酶 | 催化 | 互补突变体WL301 |
| Escherichia coli DH5α | 醛代谢 | aldB | 乙醛脱氢酶 | 催化 | 互补突变体3-12、3-90、3-93、3-94；可能解除毒性醛积累 |
| Escherichia coli DH5α | 醛代谢 | aldH | 醛脱氢酶 | 催化 | 互补突变体3-68 |
| Escherichia coli DH5α | 乙醇胺利用 | eutE | 醛脱氢酶 | 催化 | 互补突变体3-26、3-48、3-81、3-102 |
| Escherichia coli DH5α | 乙醇胺利用 | eutI | 磷酸乙酰转移酶 | 催化 | 互补突变体3-69；可能通过乙酰磷酸影响IPP合成 |
| Escherichia coli DH5α | 甲萘醌生物合成 | menF | 异分支酸合酶 | 催化 | 互补突变体3-24和3-50；过表达可使MK-8峰增加3–7倍 |
| Escherichia coli DH5α | 泛醌生物合成 | ubiB | UbiB（2-八异戊烯基苯酚羟化酶） | 催化 | 互补突变体3-8；但UQ-8产量未显著增加，可能通过其他机制影响番茄红素 |
| Escherichia coli DH5α | 异戊二烯生物合成（推测） | elb1 (f107) | 未知小蛋白（约12 kDa） | 调控 | 互补基因，功能未知，可能参与早期异戊二烯生物合成；在野生型中过表达可提高番茄红素 |
| Escherichia coli DH5α | 异戊二烯生物合成（推测） | elb2 (yhbL) | Sigma cross-reacting protein 27A | 调控 | 可能与arcB同操元，推测作为转录调节因子影响异戊二烯生物合成；在野生型中过表达可提高番茄红素 |
关键发现
- 从约21,000个转化子中分离出117个白色突变株，获得29个互补质粒
- 野生型含pACYC-IBE与pUC119时番茄红素产量为76.9 μg/g干重，UQ-8为513 μg/g
- 突变体番茄红素产量降至10.1–70.2 μg/g
- 互补质粒p3-20-01使突变体3-20番茄红素产量提高493%（相对量），p3-24-01使3-24提高376%，p3-47-13使3-47提高229%
- 在野生型中，p3-8-01使番茄红素达到79.4 μg/g，p3-69-02达到87.9 μg/g。互补基因包括IPP异构酶、ATP合酶亚基、三羧酸循环酶、醛脱氢酶、磷酸乙酰转移酶、泛醌/甲萘醌合成相关酶以及两个未知基因elb1和elb2。
研究结论
所开发的红白筛选系统能有效鉴定大肠杆菌早期异戊二烯生物合成相关基因；多数互补基因通过能量供给、醛类解毒、醌类合成等间接途径影响番茄红素形成，而elb1和elb2可能直接参与早期异戊二烯生物合成，且这些基因在野生型中也能提高番茄红素产量，具有工业应用潜力。