Plants with Increased Expression of ent-Kaurene Oxidase are Resistant to Chemical Inhibitors of this Gibberellin Biosynthesis Enzyme
- 作者
- Stephen M. Swain, Davinder P. Singh, Chris A. Helliwell, Andrew T. Poole
- 单位
- CSIRO Plant Industry, 585 River Ave, Merbein, Victoria 3505, Australia; CSIRO Plant Industry, GPO Box 1600, Canberra, ACT 2601, Australia
- 杂志
- Plant and Cell Physiology（2005）
- DOI
- 10.1093/pcp/pci027
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
探究增加内根-贝壳杉烯氧化酶（KO）表达是否能使植物对赤霉素（GA）生物合成化学抑制剂（如多效唑和烯效唑）产生抗性，并利用该材料验证抑制剂的作用靶点和GA在花粉管生长中的生理作用。
研究策略
构建35S:KO和35S:KO-GFP过表达拟南芥株系，比较其在种子萌发、营养生长和花粉管生长等不同发育阶段对KO抑制剂（paclobutrazol、uniconazole）的敏感性，并通过内源GA含量测定和花粉管体外生长实验分析表型机制。
核心内容
该研究通过在拟南芥中过表达内根-贝壳杉烯氧化酶（KO）基因（35S:KO及35S:KO-GFP），系统考察了转基因植株对赤霉素生物合成抑制剂多效唑和烯效唑的敏感性。结果显示，KO过表达株系在种子萌发和营养生长阶段对抑制剂表现出显著抗性：例如在1×10⁻⁴ M多效唑下，两个转基因株系发芽率分别达30%和47%，而野生型仅15%；在5×10⁻⁷ M多效唑下，转基因植株营养生长比野生型大30%左右。内源GA含量测定表明，正常条件下转基因与野生型植株GA4水平相近，抑制剂处理后转基因植株积累更多中间代谢物，提示抗性源于KO蛋白对抑制剂的滴定效应。此外，KO过表达花粉管对烯效唑的抑制作用明显减轻，证实该抑制剂特异作用于KO，为GA在花粉管伸长中的生理功能提供了证据。研究还发现豌豆lh-2突变体对多效唑敏感性比lh-1高约30倍。该工作首次证明KO过表达可赋予植物部分抑制剂抗性且不影响正常发育，并提出KO可作为植物遗传转化的选择性标记，以及培育抗抑制剂作物的潜在靶点。
创新点
['首次证明KO过表达使拟南芥对KO抑制剂产生部分抗性，且不影响正常条件下的植物发育和GA水平', '提出KO基因可作为植物遗传转化的选择性标记，利用抑制剂抗性筛选转基因植株', '利用KO过表达花粉管对uniconazole的抗性，证实该抑制剂对花粉管生长的抑制特异地作用于KO，支持GAs在花粉管伸长中的生理作用']
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 拟南芥（Arabidopsis thaliana） | 赤霉素（GA）生物合成 | GA3/KO | 内根-贝壳杉烯氧化酶（ent-kaurene oxidase） | 催化 | 催化ent-kaurene三步氧化为ent-kaurenoic acid；过表达导致对paclobutrazol和uniconazole部分抗性 |
| 拟南芥（Arabidopsis thaliana） | 赤霉素（GA）生物合成 | 35S:KO-GFP | KO-GFP融合蛋白 | 催化 | GFP标签不影响KO活性，用于定位和表达检测；在营养生长、种子萌发和花粉管生长中均表现出抑制剂抗性 |
| 豌豆（Pisum sativum） | 赤霉素（GA）生物合成 | LH | 内根-贝壳杉烯氧化酶（ent-kaurene oxidase） | 催化 | lh-2突变导致KO蛋白水平降低，对paclobutrazol敏感度增加约30倍 |
| 拟南芥（Arabidopsis thaliana） | 赤霉素（GA）信号转导 | SPY | SPINDLY蛋白（O-GlcNAc转移酶） | 调控 | spy-5突变体对paclobutrazol具有抗性，35S:SPY植株对paclobutrazol更敏感，作为GA信号通路对照 |
关键发现
- ['35S:KO-GFP/4a种子在1×10-5 M paclobutrazol下发芽率显著高于WT，在1×10-5 M和1×10-4 M paclobutrazol下，35S:KO-GFP/2a发芽率分别为19%和30%，8a分别为26%和47%，而WT La-er仅13%和15%', '在5×10-7 M paclobutrazol条件下，35S:KO-GFP/2a和8a营养生长比WT大30%左右（P<0.001）', '35S:KO-GFP/4a幼苗中GA4含量（3.66 ng g dry weight^-1）与WT相同，paclobutrazol处理后WT和转基因植株的ent-kaurene积累量分别为41和45 ng g FW^-1，转基因植株中ent-kaurenoic acid为2.4 ng g FW^-1，WT中检测不到', '35S:KO/5a和35S:KO-GFP/2a、8a花粉管对1×10-5 M uniconazole的抑制作用显著低于WT花粉管
- 35S:KO-GFP/4a花粉管在uniconazole下生长反而增加', '豌豆lh-2突变体对paclobutrazol的敏感性比lh-1高约30倍', '在正常生长条件下，KO过表达植株与WT表型无明显差异，且GA水平相近']
研究结论
增加KO酶水平使植物对KO抑制剂产生部分抗性，这源于KO蛋白对抑制剂的滴定效应。KO可作为植物选择标记和培育抗抑制剂作物的靶点。同时，KO过表达花粉管对uniconazole的抗性证实该抑制剂特异作用于KO，为GAs在花粉管伸长中的生理作用提供了进一步证据。