Emission of ent-Kaurene, a Diterpenoid Hydrocarbon Precursor for Gibberellins, into the Headspace from Plants
- 作者
- Minoru Otsuka, Hiromichi Kenmoku, Mikihiro Ogawa, Kazunori Okada, Wataru Mitsuhashi, Takeshi Sassa, Yuji Kamiya, Tomonobu Toyomasu, Shinjiro Yamaguchi
- 单位
- Course of the Science of Bioresources, United Graduate School of Agricultural Sciences, Iwate University (Yamagata University); Laboratory for Cellular Growth and Development, Plant Science Center, RIKEN; Department of Biology, Tokyo Gakugei University
- 杂志
- Plant and Cell Physiology（2004）
- DOI
- 10.1093/pcp/pch149
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
探究真菌赤霉素（GA）生物合成酶能否在植物中功能性表达，以及GA前体ent-kaurene这种二萜烃是否能以挥发性形式释放到植物顶空并影响邻近植物生长。
研究策略
通过农杆菌介导转化，将来源于赤霉菌（Gibberella fujikuroi）的双功能ent-kaurene合酶基因GfCPS/KS与拟南芥CPS的转运肽及GFP融合，在35S启动子驱动下于拟南芥ga1-3和ga2-1突变体中表达；分析其表型互补、ent-kaurene积累和亚细胞定位，并通过顶空收集、共培养实验及不同植物物种分析验证ent-kaurene的挥发性及生物学活性。
核心内容
该研究将真菌赤霉菌来源的双功能ent-kaurene合酶基因GfCPS/KS与拟南芥CPS转运肽及GFP融合，通过农杆菌介导转化在35S启动子驱动下表达于拟南芥ga1-3和ga2-1赤霉素缺陷突变体中。融合蛋白正确靶向质体，高表达系中ent-kaurene积累量远超野生型，并完全恢复了突变体的株高、育性和种子萌发表型。顶空分析发现这些植株以每株每小时60 ng的速率释放ent-kaurene到空气中，且共培养实验中该挥发性二萜烃可被邻近的ga1-3和ga2-1突变体吸收代谢为活性赤霉素，从而完全互补其矮化表型，但对ent-kaurene氧化酶缺陷的ga3-1突变体无效。在培养皿中仅10 pg ent-kaurene即可显著促进ga1-3幼苗生长，1 mg可完全恢复矮化和雄性不育。天然植物日本柳杉和日本扁柏也能分别以每株每小时380 ng和0.47 ng的速率释放ent-kaurene。这些结果首次证明真菌双功能环化酶可在植物中功能性表达，并揭示了ent-kaurene作为挥发性赤霉素前体在自然界中可能参与植物间通讯的生物学角色。
创新点
['首次证明真菌来源的双功能二萜环化酶（GfCPS/KS）在靶向植物质体后可功能性表达于拟南芥并恢复GA缺陷突变体表型。', '首次发现ent-kaurene可以从植物释放到顶空中，并能以挥发性形式被邻近的GA缺陷突变体吸收代谢为活性GA，进而互补其矮化、雄性不育等表型。', '证实野生植物日本柳杉（Cryptomeria japonica）和日本扁柏（Chamaecyparis obtusa）在自然状态下也能释放ent-kaurene。']
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 拟南芥（Arabidopsis thaliana）ga1-3突变体 | 赤霉素生物合成 | GfCPS/KS | GfCPS/KS | 催化 | 来自赤霉菌Gibberella fujikuroi的双功能ent-kaurene合酶，兼具CPS和KS活性；与拟南芥CPS转运肽及GFP融合后靶向质体，回补ga1-3突变体。 |
| 拟南芥（Arabidopsis thaliana）ga2-1突变体 | 赤霉素生物合成 | GfCPS/KS | GfCPS/KS | 催化 | 同上，回补ga2-1（KS缺陷）突变体。 |
| 拟南芥（Arabidopsis thaliana）ga3-1突变体 | 赤霉素生物合成 | AtKO（GA3） | ent-kaurene氧化酶（KO） | 催化 | 催化ent-kaurene氧化，ga3-1突变体该酶缺陷，导致ent-kaurene积累并释放到顶空。 |
| 拟南芥（Arabidopsis thaliana） | 赤霉素生物合成 | AtCPS（GA1） | ent-copalyl二磷酸合酶（CPS） | 催化 | 催化GGDP→CDP；其N端85氨基酸转运肽用于将GfCPS/KS靶向质体。 |
| 拟南芥（Arabidopsis thaliana） | 赤霉素生物合成 | AtKS（GA2） | ent-kaurene合酶（KS） | 催化 | 催化CDP→ent-kaurene；ga2-1突变体该酶缺陷。 |
关键发现
- ['转基因拟南芥中GfCPS/KS融合蛋白靶向质体，高表达系（1-9和2-6）中ent-kaurene积累量远高于野生型（GC-MS定量），并完全恢复ga1-3和ga2-1突变体的株高、育性和种子萌发表型（除萌发实验需外源GA外）。', '顶空分析显示，35S-TPGK 1-9系植株释放ent-kaurene的速率为60 ng h^-1每株
- 日本柳杉（约1年生）释放速率为380 ng h^-1每株
- 日本扁柏释放速率为0.47 ng h^-1每株。', '在共培养实验中，挥发性ent-kaurene可完全互补ga1-3和ga2-1突变体的矮化表型，但对ga3-1（ent-kaurene氧化酶缺陷）突变体无效。', '在9 cm培养皿中仅需10 pg ent-kaurene即可显著促进ga1-3幼苗生长
- 1 mg ent-kaurene可完全互补ga1-3和ga2-1突变体的矮化和雄性不育，但不能恢复种子萌发缺陷。', 'ga3-1突变体因ent-kaurene氧化受阻而自身释放ent-kaurene，并能互补ga1-3和ga2-1突变体的矮化表型。', 'ent-kaurene以挥发性形式供给时，对野生型拟南芥形态无显著影响，也不能互补GA最终合成步骤缺陷突变体。']
研究结论
真菌来源的GfCPS/KS在靶向拟南芥质体后能高效催化ent-kaurene合成，导致植株积累并释放大量ent-kaurene到顶空中；该挥发性二萜烃可被邻近的GA缺陷突变体吸收并代谢为活性赤霉素，从而恢复其生长和生殖表型。同时，天然植物日本柳杉和日本扁柏也释放ent-kaurene，提示ent-kaurene在自然界中可能作为挥发性信号参与植物间通讯。