Cloning and Functional Characterization of a Gene for Capsanthin-Capsorubin Synthase from Tiger Lily (Lilium lancifolium Thunb. 'Splendens')
- 作者
- Zoran Jeknić, Jeffrey T. Morré, Stevan Jeknić, Sladana Jevremović, Angelina Subotić, Tony H.H. Chen
- 单位
- Department of Horticulture, Oregon State University; Department of Chemistry, Oregon State University; Institute for Biological Research 'Siniša Stanković', University of Belgrade
- 杂志
- Plant and Cell Physiology（2012）
- DOI
- 10.1093/pcp/pcs128
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
克隆并功能鉴定卷丹(Lilium lancifolium)中负责花朵橙色/红色色素辣椒红素和辣椒玉红素合成的辣椒红素-辣椒玉红素合酶(CCS)基因，并验证其异源表达功能。
研究策略
基于CCS与番茄红素β-环化酶(LCYB)的同源性，利用3'/5'RACE从卷丹花被片克隆LLccs全长cDNA；通过RT-PCR分析表达模式；通过农杆菌介导转化将LLccs导入鸢尾愈伤组织，利用HPLC和UPLC-MS/MS检测产物验证功能；克隆启动子区域。
核心内容
本研究从卷丹（Lilium lancifolium 'Splendens'）花被片中克隆了辣椒红素-辣椒玉红素合酶基因LLccs。该基因cDNA全长1,758 bp，编码474个氨基酸，其推导蛋白与辣椒CCS及柑橘LCYB分别具有60%和63%的序列一致性。表达分析显示LLccs仅在花被片中特异性转录，叶片中无表达。通过农杆菌介导转化将该基因导入鸢尾愈伤组织，经HPLC和UPLC-MS/MS检测证实，转基因株系Lccs-1和Lccs-2中非酯化辣椒红素含量分别约为1.8和2 μg/g干重，总辣椒红素（含酯化形式）约10和13 μg/g干重，皂化后含量增加5–7倍，其中约80–85%以酯化形式存在，同时检测到辣椒玉红素。此外，LLCCS还表现出10–20%的番茄红素β-环化酶活性，提示其底物谱较宽。研究还克隆了1,877 bp的花特异性启动子。该工作首次在百合科植物中鉴定并验证了CCS基因功能，证明其可在异源植物中催化辣椒红素与辣椒玉红素的体内合成，为花色改良及类胡萝卜素营养强化提供了新的基因资源和启动子工具。
创新点
首次从百合属中克隆并功能验证CCS基因；首次在异源植物中通过稳定转化实现辣椒玉红素的体内合成；发现CCS的底物宽泛性；获得花特异性表达的启动子。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Iris germanica 'Hot Property'（非胚性愈伤组织） | 类胡萝卜素生物合成（β,β-分支的κ-黄叶素合成） | LLccs | 辣椒红素-辣椒玉红素合酶（CCS） | 催化 | 异源表达LLccs，将花药黄质和紫黄质分别转化为辣椒红素和辣椒玉红素，导致愈伤组织变红橙色 |
| Lilium lancifolium 'Splendens' | 类胡萝卜素生物合成 | LLcyB | 番茄红素β-环化酶（LCYB） | 催化 | 与CCS高度同源，用于设计引物克隆LLccs；在叶片和花被片中表达水平随花发育下降 |
关键发现
- LLccs全长cDNA为1,758 bp，包含1,425 bp ORF，编码474氨基酸，预测分子量52.97 kDa，等电点8.4；LLCCS与辣椒CCS氨基酸序列一致性60%，与柑橘LCYB一致性63%；LLccs仅在花被片中表达，叶片中无表达；转基因鸢尾愈伤组织中，两个独立株系Lccs-1和Lccs-2非酯化辣椒红素含量分别约为1.8和2 μg/g DW，总辣椒红素（含酯化）约10和13 μg/g DW，皂化后增加5-7倍，约80-85%辣椒红素为酯化形式；UPLC-MS/MS确认辣椒玉红素(m/z
- 4260)和辣椒红素(m/z
- 4304)的存在；克隆的LLccs启动子长1,877 bp；LLCCS还具备β-环化酶活性，效率为10-20%。
研究结论
成功克隆并功能验证了卷丹的辣椒红素-辣椒玉红素合酶基因LLccs，该基因仅在花中表达，能在异源植物中催化辣椒红素和辣椒玉红素合成，为植物花色改造和类胡萝卜素营养价值提升提供了工具。