Isolation and Characterization of AaWRKY1, an Artemisia annua Transcription Factor that Regulates the Amorpha-4,11-diene Synthase Gene, a Key Gene of Artemisinin Biosynthesis
- 作者
- Dongming Ma, Gaobin Pu, Caiyan Lei, Lanqing Ma, Huahong Wang, Yanwu Guo, Jianlin Chen, Zhigao Du, Hong Wang, Guofeng Li, Hechun Ye, Benye Liu
- 单位
- Key Laboratory of Photosynthesis and Environmental Molecular Physiology, Institute of Botany, The Chinese Academy of Sciences, Nanxincun 20, Haidian District, 100093 Beijing, PR China
- 杂志
- Plant and Cell Physiology（2009）
- DOI
- 10.1093/pcp/pcp149
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析青蒿素生物合成途径中关键酶ADS基因的转录调控机制，此前该途径在转录水平的调控尚未见报道。
研究策略
从青蒿腺毛cDNA文库中分离WRKY转录因子AaWRKY1，通过序列分析、表达模式、亚细胞定位、EMSA、酵母单杂交、稳定/瞬时转化等实验验证其与ADS启动子W-box直接结合并激活转录。
核心内容
该研究首次从青蒿腺毛cDNA文库中分离并鉴定了一个WRKY转录因子AaWRKY1，旨在解析青蒿素生物合成途径中关键酶基因ADS的转录调控机制。通过序列分析、亚细胞定位、凝胶迁移实验、酵母单杂交以及稳定和瞬时转化等多种手段，作者证实AaWRKY1能够直接结合ADS启动子中的W-box元件（TTGACC）并激活其转录。在稳定共转化的烟草中，AaWRKY1使ADS启动子驱动的GUS活性提高约4至5倍；而W-box单突变导致GUS表达下降40%至70%，双突变则完全取消激活。在青蒿叶片中瞬时过表达AaWRKY1后，HMGR、ADS、CYP71AV1和DBR2的转录水平分别增加5.18、6.56、3.01和3.84倍，FPS不受影响。此外，AaWRKY1还能上调烟草中5-epi-aristolochone合酶基因EAS4的表达。这些结果揭示AaWRKY1是青蒿素生物合成的正向调控因子，可作为提高青蒿素产量的潜在代谢工程靶点。
创新点
首次从青蒿中分离并鉴定调控ADS基因的WRKY转录因子AaWRKY1，证明其通过结合W-box正向调控ADS及其他多个青蒿素生物合成基因的表达。
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Artemisia annua | 青蒿素生物合成 | AaWRKY1 | AaWRKY1 | 调控 | WRKY转录因子，结合ADS启动子W-box元件，激活下游基因表达 |
| Artemisia annua | 青蒿素生物合成 | ADS | Amorpha-4,11-diene synthase | 催化 | 催化FPP环化生成amorpha-4,11-diene，青蒿素生物合成首个限速酶，受AaWRKY1激活（转录水平增加6.56倍） |
| Artemisia annua | 青蒿素生物合成 | HMGR | 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase | 催化 | 甲羟戊酸途径关键酶，受AaWRKY1上调（转录水平增加5.18倍） |
| Artemisia annua | 青蒿素生物合成 | CYP71AV1 | Cytochrome P450 enzyme | 催化 | 催化amorpha-4,11-diene的氧化步骤，受AaWRKY1上调（转录水平增加3.01倍） |
| Artemisia annua | 青蒿素生物合成 | DBR2 | Artemisinic aldehyde Δ11(13) reductase | 催化 | 催化artemisinic aldehyde还原，受AaWRKY1上调（转录水平增加3.84倍） |
| Artemisia annua | 青蒿素生物合成 | FPS | Farnesyl diphosphate synthase | 催化 | 催化IPP和DMAPP生成FPP，不受AaWRKY1调控 |
| Nicotiana tabacum | 倍半萜生物合成 | EAS4 | 5-epi-aristolochone synthase | 催化 | 烟草倍半萜环化酶，受异源AaWRKY1上调表达 |
| Saccharomyces cerevisiae | 青蒿素生物合成 | AaWRKY1 | AaWRKY1 | 调控 | 酵母单杂交系统中证明AaWRKY1与W-box结合并激活报告基因 |
| Escherichia coli | 青蒿素生物合成 | AaWRKY1 | AaWRKY1 | 调控 | 用于重组蛋白表达及EMSA实验 |
关键发现
- AaWRKY1 cDNA全长1478 bp，含936 bp ORF，编码311个氨基酸蛋白，分子量34.70 kDa，等电点5.31
- 其与AtWRKY53序列同一性为32.5%。AaWRKY1在腺毛中高表达，并受甲基茉莉酸（0.3 mM）和壳聚糖（150 mg/L）快速诱导（约30 min达峰），先于ADS诱导表达。EMSA和酵母单杂交证实AaWRKY1特异结合ADS启动子W-box（TTGACC）。在稳定共转化烟草中，AaWRKY1使ADSpro1驱动的GUS活性提高约4-5倍
- 在瞬时表达系统中，W-box单突变（mW_A、mW_B）使GUS表达分别降低约40-50%和60-70%，双突变（mW_AB）完全取消激活。在青蒿叶片瞬时过表达AaWRKY1后，HMGR、ADS、CYP71AV1、DBR2转录水平分别增加5.18±0.75、6.56±0.65、3.01±0.57和3.84±0.80倍，而FPS不受影响。此外，AaWRKY1在烟草中可上调5-epi-aristolochone合酶基因EAS4的表达。
研究结论
AaWRKY1是ADS的转录激活因子，通过结合W-box正向调控青蒿素生物合成，可能成为提高青蒿素产量的代谢工程靶点。