Molecular Studies of the Protein Complexes Involving Cis-Prenyltransferase in Guayule (Parthenium argentatum), an Alternative Rubber-Producing Plant
- 作者
- Adam M. Lakusta, Moonyhuk Kwon, Eun-Joo G. Kwon, Solomon Stonebloom, Henrik V. Scheller, Dae-Kyun Ro
- 单位
- Department of Biological Sciences, University of Calgary; Division of Applied Life Science (BK21 Plus), Plant Molecular Biology and Biotechnology Research Center, College of Natural Sciences, Gyeongsang National University; Joint BioEnergy Institute, Lawrence Berkeley National Laboratory, University of California, Berkeley
- 杂志
- Frontiers in Plant Science（2019）
- DOI
- 10.3389/fpls.2019.00165
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
银胶菊（Parthenium argentatum）是天然橡胶的替代植物，但其顺式聚异戊二烯生物合成相关的酶（尤其是顺式异戊烯基转移酶CPT及其结合蛋白CBP）尚未在分子水平上得到系统研究。论文旨在鉴定银胶菊中的CPT和CBP同源基因，并研究其蛋白复合物的形成、生化活性及表达模式，以期为提高银胶菊天然橡胶产量提供基础。
研究策略
从银胶菊转录组中鉴定出3个PaCPT（PaCPT1-3）和1个PaCBP基因；通过系统发育分析、酵母缺失互补实验、体外酶活测定、split-ubiquitin酵母双杂交、免疫共沉淀以及RNA-seq表达分析，全面研究这些蛋白的功能与互作。
核心内容
该研究以天然橡胶替代植物银胶菊为对象，从转录组中鉴定出3个顺式异戊烯基转移酶基因（PaCPT1–3）和1个结合蛋白基因（PaCBP），并系统表征了其功能。通过系统发育分析发现PaCPT1属于多萜醇合成的初级代谢分支，而PaCPT2和PaCPT3与已知橡胶合成相关CPT聚类。酵母缺失互补实验表明，单独表达任一PaCPT或PaCBP均不能挽救rer2Δsrt1Δ致死表型，但任一PaCPT与PaCBP共表达均可有效互补，证明这些蛋白必须以异源复合物形式发挥功能。体外酶活测定显示，PaCPT1/PaCBP、PaCPT2/PaCBP和PaCPT3/PaCBP复合物的比活分别为13.0、45.4和22.0 pmol IPP μg⁻¹ h⁻¹，显著高于对照RER2的2.9 pmol IPP μg⁻¹ h⁻¹，产物为脱氢多萜醇二磷酸，未观察到高分子量橡胶生成。split-ubiquitin酵母双杂交和免疫共沉淀均证实了PaCPT与PaCBP的特异性互作。RNA-seq分析显示PaCPT3在茎中表达量最高，比PaCPT1/2高2–3个数量级，冷处理使其上调1.8倍，PaCBP也上调2.2倍，提示PaCPT3是银胶菊天然橡胶合成的关键酶。该研究为通过基因工程改造PaCPT3和PaCBP以提高银胶菊天然橡胶产量奠定了分子基础。
创新点
首次对银胶菊的CPT和CBP进行分子水平鉴定；证明PaCPT/PaCBP形成异源蛋白复合物并能在酵母中互补多萜醇（dolichol）缺陷；通过RNA-seq发现PaCPT3在茎中高表达且受冷诱导，提示其参与天然橡胶合成。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） | 多萜醇生物合成 | PaCPT1 | PaCPT1 | 催化 | 银胶菊顺式异戊烯基转移酶1，与PaCBP共表达可互补rer2Δsrt1Δ酵母缺陷 |
| 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） | 多萜醇生物合成 | PaCPT2 | PaCPT2 | 催化 | 银胶菊顺式异戊烯基转移酶2，系统发育与天然橡胶相关CPT聚为一支 |
| 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） | 天然橡胶（顺式聚异戊二烯）生物合成 | PaCPT3 | PaCPT3 | 催化 | 茎中高表达且冷诱导上调1.8倍，被认为是银胶菊天然橡胶合成的关键CPT |
| 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） | 多萜醇/天然橡胶生物合成 | PaCBP | PaCBP | 调控 | CPT结合蛋白，与PaCPT1-3形成异源复合物，激活并锚定CPT至内质网 |
| 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） | 多萜醇生物合成 | RER2 | RER2 | 催化 | 酵母内源CPT，作为对照实验，单独表达时比活较低 |
| 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） | 多萜醇生物合成 | SRT1 | SRT1 | 催化 | 酵母内源CPT，与RER2共同缺失的菌株用于互补实验 |
关键发现
- 鉴定出银胶菊3个PaCPT（PaCPT1-3）和1个PaCBP，PaCPT1属于参与多萜醇合成的初级代谢分支，PaCPT2和PaCPT3与已知参与天然橡胶合成的CPT聚为一支。
- 酵母互补实验显示，单独表达PaCBP或任一PaCPT均不能挽救rer2Δsrt1Δ酵母致死，而PaCBP与任一PaCPT共表达均可有效互补。
- 体外微体酶活测定显示，PaCPT1/PaCBP、PaCPT2/PaCBP、PaCPT3/PaCBP的比活分别为13.0±1.7、45.4±1.3、22.0±0.4 pmol IPP μg−1 h−1，IPP掺入率分别为14.4±0.5%、50.8±5.0%、24.6±2.6%；对照RER2的比活为2.9±0.4 pmol IPP μg−1 h−1，掺入率2.9±0.1%。产物为脱氢多萜醇二磷酸（dehydrodolichyl diphosphate），分子量未超过多萜醇（dolichol）级别，未观察到大分子量天然橡胶生成。
- split-ubiquitin酵母双杂交和免疫共沉淀均证实PaCPT1-3与PaCBP之间存在特异性蛋白相互作用。
- RNA-seq分析显示，PaCPT3在茎中表达量最高（比PaCPT1/2高2-3个数量级），冷处理使茎中PaCPT3表达上调1.8倍，PaCBP在茎中表达上调2.2倍，提示PaCPT3是银胶菊天然橡胶生物合成的关键CPT。
研究结论
银胶菊中的PaCPT1-3均需与PaCBP形成异源蛋白复合物才能发挥催化活性，合成类多萜醇产物；其中PaCPT3最可能参与天然橡胶合成。这些结果为通过基因工程改造PaCPT3和PaCBP以提高银胶菊天然橡胶产量提供了基础。