高级醇 · 代谢工程文献库

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Combinatorial transient gene expression strategies to enhance terpenoid production in plants

作者
Soyoung Park, Vimalraj Mani, Jin A. Kim, Soo In Lee, Kijong Lee
单位
Department of Agricultural Biotechnology, National Institute of Agricultural Sciences, Rural Development Administration, Jeonju, Republic of Korea
杂志
Frontiers in Plant Science（2022）
DOI
10.3389/fpls.2022.1034893
所属领域
代谢工程
关键词
MEPMVAagroinfiltrationcostunolidelinaloolterpenoidtransient expression
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解决的核心问题

如何通过组合瞬时表达策略提高植物中单萜沉香醇（linalool）和倍半萜木香烃内酯（costunolide）的产量

研究策略

利用MoClo golden gate模块化克隆系统组装MEP和MVA途径关键基因，通过农杆菌浸润（agroinfiltration）在本氏烟草叶片中单独或组合瞬时表达，并用GC-Q-Orbitrap-MS定量检测目标产物

研究路线图

100%
研究问题：如何提高植物萜类产量？
策略：MoClo系统组装MEP/MVA关键基因
MEP途径：单独表达DXS/DXR/LIS等基因
MVA途径：单独表达HMGR/GAS/GAO/COS等基因
关键改造：组合表达MEP限速酶+合酶
关键改造：组合表达MVA限速酶+合酶
结果：基因表达上调5-95倍，产物含量提升
结果：组合表达产量最高达94 ng/mg鲜重
结论：组合瞬时表达策略为萜类工业化生产提供可行平台
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核心内容

本研究利用MoClo Golden Gate模块化克隆系统，将MEP途径限速酶基因（DXS、DXR）与单萜合酶LIS，以及MVA途径限速酶HMGR与倍半萜合酶基因（GAS、GAO、COS）进行组合，通过农杆菌浸润在本氏烟草叶片中瞬时共表达，并以GC-Q-Orbitrap-MS定量检测产物。结果显示，所有基因表达量较对照上调5.05至94.87倍。单独表达MEP基因时，linalool产量为19至77 ng/mg鲜重；组合表达DXS+DXR+LIS时产量最高达94 ng/mg鲜重，显著高于野生型对照的38 ng/mg。在MVA途径中，单独表达HMGR时costunolide产量最高为48 ng/mg鲜重，而六基因组合（AAT+HMGR+FPS+GAS+GAO+COS）产量达94 ng/mg鲜重，野生型对照不产生costunolide。该策略证明限速酶与终端合酶的组合瞬时表达能显著提高植物中单萜和倍半萜的积累水平，为利用植物作为底盘高效异源生产高价值萜类化合物提供了可行平台。

创新点

将MEP途径限速酶（DXS/DXR）与终端合酶LIS组合，以及将MVA途径限速酶HMGR与GAS/GAO/COS组合，实现了linalool和costunolide的高效积累；证明多基因组合瞬时表达比单独表达更能显著提高植物萜类产量

研究对象（12）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Nicotiana benthamiana MEP DXS 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase 催化 来自烟草（NtDXS），限速酶
Nicotiana benthamiana MEP DXR 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase 催化 来自烟草（NtDXR），限速酶
Nicotiana benthamiana MEP CMK 4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol kinase 催化 来自烟草（NtCMK）
Nicotiana benthamiana MEP IDI isopentenyl-diphosphate isomerase 催化 来自烟草（NtIDI）
Nicotiana benthamiana MEP GPPS geranyl pyrophosphate synthase 催化 来自烟草（NtGPPS）
Nicotiana benthamiana MEP LIS linalool synthase 催化 来自Clarkia breweri（CbLIS）
Nicotiana benthamiana MVA AAT acetoacetyl-CoA thiolase 催化 来自拟南芥（AtAAT）
Nicotiana benthamiana MVA HMGR 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase 催化 来自本氏烟草（NbHMGR），限速酶
Nicotiana benthamiana MVA FPS farnesyl pyrophosphate synthase 催化 来自拟南芥（AtFPS）
Nicotiana benthamiana MVA GAS germacrene A synthase 催化 来自菊苣（CiGAS）
Nicotiana benthamiana MVA GAO germacrene A oxidase 催化 来自菊苣（CiGAO）
Nicotiana benthamiana MVA COS costunolide synthase 催化 来自莴苣（LsCOS）

关键发现

  1. 所有选定的MEP和MVA途径基因在农杆菌浸润5天后均获得瞬时过表达，相对表达量较对照上调5.05-94.87倍（具体为DXS
  2. 8倍、DXR
  3. 09倍、CMK
  4. 65倍、IDI
  5. 87倍、GPPS
  6. 76倍、LIS
  7. 05倍；AAT
  8. 1倍、HMGR
  9. 5倍、FPS
  10. 3倍、GAS
  11. 3倍、GAO
  12. 7倍、COS
  13. 3倍）。单独表达MEP基因时，DXS、DXR和LIS的linalool产量为70-77 ng/mg鲜重，CMK、GPPS和IDI为19-32 ng/mg；组合表达DXS+DXR+LIS时linalool产量最高达94 ng/mg鲜重，而野生型（WT）和空农杆菌（Agro）对照分别为38和41 ng/mg。单独表达MVA基因时，HMGR的costunolide产量最高，为48 ng/mg鲜重，AAT和COS为10-14 ng/mg，GAO、FPS、GAS和HMGR为23-48 ng/mg；组合表达GAS+GAO+COS时产量为64 ng/mg，HMGR+GAS+GAO+COS为67 ng/mg，六基因组合（AAT+HMGR+FPS+GAS+GAO+COS）产量最高达94 ng/mg鲜重，而WT和Agro对照不产生costunolide

研究结论

通过MoClo系统组合瞬时表达MEP和MVA途径关键基因，尤其是限速酶与终端合酶的有效组合，能在本氏烟草叶片中高效合成linalool和costunolide，最高产量均可达94 ng/mg鲜重，为工业化异源生产这些重要萜类化合物提供了可行平台