Isolation of cells specialized in anticancer alkaloid metabolism by fluorescence activated cell sorting
- 作者
- Inês Carqueijeiro, Ana Luísa Guimarães, Sara Bettencourt, Teresa Martínez-Cortés, Joana G. Guedes, Rui Gardner, Telma Lopes, Cláudia Andrade, Cláudia Bispo, Nuno Pimpão Martins, Paula Andrade, Patrícia Valentão, Inês M. Valente, José A. Rodrigues, Patrícia Duarte, Mariana Sottomayor
- 单位
- CIBIO/InBIO - Centro de Investigação em Biodiversidade e Recursos Genéticos, Universidade do Porto; IBMC – Instituto de Biologia Molecular e Celular, Universidade do Porto; Departamento de Biologia, Faculdade de Ciências da Universidade do Porto; ICBAS – Instituto de Ciências Biológicas Abel Salazar, Universidade do Porto; Instituto Gulbenkian de Ciência; REQUIMTE/Laboratório de Farmacognosia, Departamento de Química, Faculdade de Farmácia, Universidade do Porto; REQUIMTE/LAQV - Departamento de Química e Bioquímica, Faculdade de Ciências, Universidade do Porto
- 杂志
- Plant Physiology（2016）
- DOI
- 10.1104/pp.16.01028
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
Catharanthus roseus中抗癌生物碱长春碱和长春新碱的生物合成途径具有复杂的细胞特异性区室化，晚期步骤发生在特化的叶肉细胞（异形细胞）中，但这些细胞数量稀少，难以分离，限制了途径的完整解析和工程改造。
研究策略
利用异形细胞独特的自发荧光特性，优化FACS条件，从C. roseus叶片原生质体混合物中分选异形细胞和普通叶肉细胞，并验证其适用于转录组和代谢组分析。
核心内容
本研究利用长春花叶片异形细胞的自发荧光特性，优化荧光激活细胞分选（FACS）条件，不经外源标记即从原生质体混合物中分离出高纯度异形细胞。该方法每日可分选约50,000个细胞，纯度约90%，较激光显微切割效率大幅提升；约50,000个细胞可获得200 ng高质量RNA（RQI≥8），满足转录组分析需求。qPCR显示，参与抗癌生物碱晚期合成的D4H和DAT基因在异形细胞中的转录水平约为普通叶肉细胞的3倍；LC-MS/MS测得异形细胞中vindoline含量为每细胞315.22 ng，而普通叶肉细胞仅0.105 ng，相差约3000倍。该研究建立了高效分离稀有特化细胞的技术路径，为完整解析长春花萜类吲哚生物碱的生物合成、运输及调控机制奠定了基础，也为此类细胞特异性代谢途径的工程改造提供了可行工具。
创新点
首次基于自发荧光而非外源荧光标记，通过FACS从C. roseus叶片中分离高纯度的异形细胞，实现了每天约50,000个细胞的高通量分选，相较于激光显微切割（LCM）效率大幅提高，且分选细胞适用于下游组学研究。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Catharanthus roseus 叶片异形细胞（idioblast protoplasts） | 萜类吲哚生物碱生物合成 | — | — | 区室化 | 特异积累生物碱的自发性荧光细胞，是FACS分选的目标群体 |
| Catharanthus roseus (cv. Little Bright Eye) | 萜类吲哚生物碱生物合成 | D4H | desacetoxyindoline 4-hydroxylase | 催化 | 参与vindoline生物合成晚期步骤，在异形细胞中表达量约3倍升高 |
| Catharanthus roseus (cv. Little Bright Eye) | 萜类吲哚生物碱生物合成 | DAT | deacetylindoline 4-O-acetyltransferase | 催化 | 参与vindoline生物合成晚期步骤，在异形细胞中表达量约3倍升高 |
关键发现
- FACS成功分离出纯度约90%的异形细胞群，每个操作日可回收约50,000个异形细胞和数十倍更多的普通叶肉细胞
- 约50,000个分选细胞可获得200 ng高质量RNA（RQI≥8），适合转录组分析
- qPCR显示，参与TIA晚期生物合成的D4H和DAT基因在异形细胞中的转录水平约为普通叶肉细胞的3倍
- LC-MS/MS检测到分选的异形细胞中vindoline含量为每细胞315.22 ng，而普通叶肉细胞仅为0.105 ng，相差约3000倍。
研究结论
本研究建立了一种基于自发荧光的FACS方法，可高效分离C. roseus叶片中高纯度的异形细胞原生质体，所得细胞数量和RNA质量满足转录组和代谢组分析需求，为阐明抗癌萜类吲哚生物碱的完整生物合成、运输和调控机制奠定了基础。