Engineering Triterpene and Methylated Triterpene Production in Plants Provides Biochemical and Physiological Insights into Terpene Metabolism
- 作者
- Zuodong Jiang, Chase Kempinski, Caroline J. Bush, S. Eric Nybo, Joe Chappell
- 单位
- Plant Biology Program, University of Kentucky, Lexington, KY 40536-0596; Department of Pharmaceutical Sciences, University of Kentucky, Lexington, KY 40536-0596; Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, Ferris State University, Big Rapids, MI
- 杂志
- Plant Physiology（2016）
- DOI
- 10.1104/pp.15.01548
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何在植物中实现高水平的非天然三萜（botryococcene）及其甲基化衍生物的生产，并利用不同亚细胞区室（细胞质与叶绿体）的工程改造来探究植物三萜代谢的内在调控机制和辅因子分布。
研究策略
将来源于绿藻Botryococcus braunii的botryococcene合酶（SSL1-3或SSL1-3M融合蛋白）与禽源法尼基焦磷酸合酶（FPS）共表达，分别靶向烟草的细胞质或叶绿体；随后在已积累C30三萜的植株中导入三萜甲基转移酶（TMT-1、TMT-2、TMT-3），并同样进行细胞质或叶绿体定位，检测三萜及甲基化产物的积累水平。
核心内容
该研究通过在烟草中异源表达来源于绿色微藻Botryococcus braunii的三萜合成与甲基化酶系，系统比较了细胞质与叶绿体两种亚细胞区室靶向策略对三萜及其甲基化衍生物产量的影响。研究者将botryococcene合酶融合蛋白SSL1-3或其膜锚定版本SSL1-3M与禽源FPS共表达，分别定位于细胞质或叶绿体，随后在产三萜植株中导入三种三萜甲基转移酶TMT-1/2/3。结果显示，叶绿体靶向策略将botryococcene最高积累量提升至544 μg/g FW，平均269 μg/g FW，约为细胞质靶向（平均3.5 μg/g FW）的90倍。在squalene积累株系中，叶绿体靶向TMT-1使平均65%的squalene被甲基化，而细胞质靶向仅4%。此外，野生型中细胞质表达TMT-1使总三萜水平提高4-7倍。约75%的叶绿体工程株出现矮化褪绿表型，但squalene积累株无此现象。该研究表明叶绿体定位可有效绕过细胞质代谢限制，将MEP通路碳流导向高价值三萜积累，同时揭示squalene可能参与甾醇稳态调控，为植物生产三萜类生物燃料前体提供了可行策略。
创新点
['首次在烟草中实现高水平的botryococcene（C30）及其甲基化衍生物（C31、C32）的工程化生产。', '揭示了叶绿体靶向策略而非细胞质靶向能显著提高三萜产量，并发现叶绿体中缺乏细胞质中存在的代谢调节限制。', '通过对比不同区室中TMT的甲基化效率，证明了内源squalene存在亚细胞区室差异，并提出了squalene可能参与甾醇生物合成的稳态调控。']
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 烟草 (Nicotiana tabacum) | 类异戊二烯途径（MVA/MEP） | FPS (P08836) | 禽源法尼基焦磷酸合酶 (avian farnesyl diphosphate synthase) | 催化 | 与三萜合酶共表达，提供FPP底物，可靶向细胞质或叶绿体 |
| 烟草 (Nicotiana tabacum) | 三萜生物合成 | SSL1-3 (fusion of SSL-1 and SSL-3) | SSL1-3 botryococcene合酶融合蛋白 | 催化 | 催化两分子FPP经PSPP生成botryococcene；可溶性形式，靶向细胞质或叶绿体 |
| 烟草 (Nicotiana tabacum) | 三萜生物合成 | SSL1-3M (SSL1-3 with C-terminal membrane domain from Botryococcus squalene synthase) | SSL1-3M botryococcene合酶融合蛋白（含膜锚定域） | 催化 | 通过C端71个氨基酸膜锚定域整合到ER膜（细胞质定位）或叶绿体膜，提高底物接近性 |
| 烟草 (Nicotiana tabacum) | 三萜甲基化 | TMT-1 (JN828962.1) | 三萜甲基转移酶1 (triterpene methyltransferase 1) | 催化 | 优先甲基化squalene，生成单甲基(C31)和二甲基(C32)产物；叶绿体靶向时最高91%甲基化 |
| 烟草 (Nicotiana tabacum) | 三萜甲基化 | TMT-2 (JN828963.1) | 三萜甲基转移酶2 (triterpene methyltransferase 2) | 催化 | 优先甲基化squalene，主要生成单甲基(C31)；叶绿体靶向时最高82%甲基化 |
| 烟草 (Nicotiana tabacum) | 三萜甲基化 | TMT-3 (JN828964.1) | 三萜甲基转移酶3 (triterpene methyltransferase 3) | 催化 | 优先甲基化botryococcene，也用于squalene但活性低；叶绿体靶向时在botryococcene积累株系中最高87%甲基化 |
关键发现
- 叶绿体靶向表达SSL1-3+tpFPS的烟草中botryococcene最高积累量达544 μg/g FW（平均269 μg/g FW），是细胞质靶向（平均3.5 μg/g FW）的约90倍
- 膜锚定版本SSL1-3M在叶绿体靶向时最高202 μg/g FW（平均131 μg/g FW），而细胞质靶向平均仅5.8 μg/g FW。成熟叶中botryococcene含量比幼叶高2-4倍，根中仅含微量（不超过25 μg/g）。在squalene积累株系中，叶绿体靶向TMT-1使squalene最高91%、平均65%被甲基化（其中约三分之二为二甲基化C32），TMT-2最高82%、平均51%甲基化（约三分之一为二甲基化）
- 而细胞质靶向TMT-1/2平均仅4%甲基化。在野生型烟草中，细胞质表达TMT-1使总squalene（C30+C31+C32）水平提高4-7倍（最高55 μg/g FW，平均36 μg/g FW），且甲基化比例平均达72%
- TMT-2为67%。在botryococcene积累株系中，叶绿体靶向TMT-3在tpSSL1-3M+tpFPS背景下最高87%、平均54%的botryococcene被甲基化
- 在tpSSL1-3+tpFPS背景下最高66%、平均35%
- 而细胞质靶向TMT-3仅产生3-14%的甲基化产物。此外，约75%的叶绿体靶向botryococcene工程株系表现出矮化、褪绿和斑驳等表型，但squalene积累株系无此表型。
研究结论
将Botryococcus braunii的三萜合成途径（SSL1-3/SSL1-3M、FPS和TMT）靶向烟草叶绿体，能够高效地将MEP通路的碳流导向三萜及甲基化三萜的积累，产量远高于细胞质工程。该研究不仅提供了一种植物生产高价值三萜类生物燃料前体的可行策略，还揭示了三萜在细胞质和叶绿体之间的分布差异、SAM供给的充足性，以及squalene在甾醇生物合成中潜在的稳态调控作用。