Elicitor-Inducible 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl Coenzyme A Reductase Activity Is Required for Sesquiterpene Accumulation in Tobacco Cell Suspension Cultures
- 作者
- Joseph Chappell, Carol VonLanken, Urs Vogeli
- 单位
- Plant Physiology/Biochemistry Program, Agronomy Department, University of Kentucky, Lexington, Kentucky 40546-0091
- 杂志
- Plant Physiology（1991）
- DOI
- 10.1104/pp.97.2.693
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
探究诱导型HMGR酶活性是否对烟草细胞悬浮培养物中倍半萜（capsidiol）的积累是必需的，并解析不同激发子处理对倍半萜生物合成途径关键酶活性的影响。
研究策略
使用 Phytophthora parasitica 细胞壁水解物、里氏木霉纤维素酶和日本曲霉果胶酶分别处理烟草细胞悬浮培养物，比较 capsidiol 积累、关键酶（HMGR、倍半萜环化酶、PAL、角鲨烯合成酶）活性以及放射性前体（[14C]acetate 和 [3H]mevalonate）掺入路径的差异，从而验证诱导型 HMGR 的必要性。
核心内容
该研究以烟草细胞悬浮培养物为对象，探究诱导型3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGR）活性是否为倍半萜capsidiol积累所必需。研究者分别用致病疫霉细胞壁水解物、里氏木霉纤维素酶和日本曲霉果胶酶处理细胞，比较capsidiol积累量及关键酶活性变化。结果显示，纤维素酶处理产生最高capsidiol产量达71.2 μg/g鲜重，约为疫霉激发子处理（45.4 μg/g）的1.5~2倍；HMGR活性在对照中为2.7 nmol/mg protein·h，纤维素酶处理后升至78.5（约29倍），而果胶酶处理仅3.7，未显著诱导。尽管果胶酶同样诱导了倍半萜环化酶和苯丙氨酸解氨酶并抑制了角鲨烯合成酶活性（下降超65%），却未产生capsidiol。放射性标记实验进一步表明果胶酶处理下[14C]acetate掺入capsidiol极低（0.4%），而[3H]mevalonate掺入明显，说明甲羟戊酸之前的步骤限制了合成。该结果直接证明诱导型HMGR活性是倍半萜积累的必需条件，组成型HMGR不足以支撑该代谢分支，并暗示不同类型HMGR可能分别服务于倍半萜与甾醇合成。
创新点
利用果胶酶处理能诱导下游倍半萜合成酶和 PAL 但不诱导 HMGR 的特性，直接证明诱导型 HMGR 活性是倍半萜积累所必需的，并暗示组成型与诱导型 HMGR 可能分别服务于不同的异戊二烯代谢分支。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 烟草（Nicotiana tabacum L. cv KY 14）细胞悬浮培养物 | 倍半萜生物合成途径 | — | 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGR, EC 1.1.1.34） | 催化 | 诱导型 HMGR 活性是 capsidiol 积累所必需；果胶酶处理不诱导此酶 |
| 烟草（Nicotiana tabacum L. cv KY 14）细胞悬浮培养物 | 倍半萜生物合成途径 | — | 倍半萜环化酶（sesquiterpene cyclase） | 催化 | 倍半萜生物合成的第一个关键酶（committed step）；果胶酶处理仅诱导约20%-50%活性 |
| 烟草（Nicotiana tabacum L. cv KY 14）细胞悬浮培养物 | 苯丙烷代谢途径 | — | 苯丙氨酸解氨酶（PAL, EC 4.3.1.5） | 催化 | 作为与倍半萜代谢无关的诱导型防御酶被用于对照；三种激发子均强烈诱导 |
| 烟草（Nicotiana tabacum L. cv KY 14）细胞悬浮培养物 | 甾醇生物合成途径 | — | 角鲨烯合成酶（squalene synthetase, EC 2.5.1.21） | 催化 | 甾醇途径的第一个关键酶；被激发子处理抑制超过65%，以减少与倍半萜竞争法尼基焦磷酸 |
关键发现
- 纤维素酶（0.1 μg/mL）处理烟草细胞培养物后，capsidiol 产量最高达
- 2 μg/g 鲜重，是 Pp 激发子最优浓度（30 μg Glc equivalents/mL，45.4 μg/g 鲜重）的
- 5~2 倍；果胶酶处理不产生 capsidiol。HMGR 活性在对照中为
- 7 nmol/mg protein·h，Pp 激发子处理 6 h 后为 46（约 17 倍），纤维素酶处理为
- 5（约 29 倍），果胶酶处理仅
- 7（无显著诱导）。倍半萜环化酶活性分别为：对照 0，Pp
- 8，纤维素酶
- 5，果胶酶
- 8（约为纤维素酶的 20%~50%）。PAL 活性对照为 75，Pp 为 550，纤维素酶为 690，果胶酶为 760，均显著诱导。角鲨烯合成酶活性对照为
- 7，随激发子处理降至
- 2~2.1，抑制超过 65%。放射性标记实验中，Pp 激发子使 [14C]acetate 掺入甾醇的比例从对照的
- 3% 降至
- 6%，[3H]mevalonate 掺入甾醇比例相应下降；果胶酶处理下 [14C]acetate 掺入胞外 capsidiol 的放射性极低（0.4%），但 [3H]mevalonate 掺入量为 19,780 dpm（占 2%），表明甲羟戊酸之前的步骤限制 capsidiol 合成。
研究结论
诱导型 HMGR 活性是烟草细胞悬浮培养物中倍半萜（capsidiol）积累所必需的。果胶酶处理虽然诱导了倍半萜环化酶和 PAL 等防御酶并抑制了甾醇合成，但因不能诱导 HMGR，导致无法积累 capsidiol，证实组成型 HMGR 活性不足以支撑倍半萜生物合成。