Coexpression analysis identifies two oxidoreductases involved in the biosynthesis of the monoterpene acid moiety of natural pyrethrin insecticides in Tanacetum cinerariifolium
- 作者
- Haiyang Xu, Gaurav D. Moghe, Krystle Wiegert-Rininger, Anthony L. Schilmiller, Cornelius S. Barry, Robert L. Last, Eran Pichersky
- 单位
- Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of Michigan; Department of Biochemistry, Michigan State University; Department of Horticulture, Michigan State University; Mass Spectrometry and Metabolomics Core Facility, Michigan State University; Department of Plant Biology, Michigan State University
- 杂志
- Plant Physiology（2017）
- DOI
- 10.1104/pp.17.01330
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
鉴定天然除虫菊酯中单萜酸部分（trans-chrysanthemic acid）生物合成途径中催化trans-chrysanthemol氧化为trans-chrysanthemal再氧化为trans-chrysanthemic acid的氧化还原酶。
研究策略
利用RNAseq共表达分析筛选候选基因，结合体外酶活测定和烟草（Nicotiana benthamiana）瞬时共表达验证基因功能。
核心内容
天然除虫菊酯中的单萜酸部分（trans-chrysanthemic acid）是其杀虫活性的关键结构，但其生物合成中由醇氧化为醛再氧化为酸这两步氧化还原反应一直缺乏明确的酶学证据。该研究以除虫菊（Tanacetum cinerariifolium）为材料，利用RNA-seq共表达分析筛选候选基因，随后通过在大肠杆菌中异源表达进行体外酶活测定，并在本氏烟草中进行瞬时共表达验证功能。结果鉴定到两个氧化还原酶：TcADH2催化trans-chrysanthemol氧化为trans-chrysanthemal，其Km为236.0 μM；TcALDH1进一步催化trans-chrysanthemal氧化为trans-chrysanthemic acid，对NADP⁺和NAD⁺的Km分别为4.4和4.6 μM。在烟草中单独表达TcCDS仅产生18.3 nmol/g FW的醇及痕量酸，而共表达TcCDS、TcADH2和TcALDH1后，trans-chrysanthemic acid产量达到818.4 nmol/g FW，较单独表达TcCDS提高122倍，总产量（含糖基化或酯化修饰形式）为1946.6 nmol/g FW。该工作填补了除虫菊酯生物合成途径中关键氧化步骤的酶学空白，证明了这三个基因共表达可在异源宿主高效合成目标酸，为除虫菊酯类杀虫剂的代谢工程生产提供了明确的基因元件和策略基础。
创新点
首次鉴定并功能表征了TcADH2（trans-chrysanthemol脱氢酶）和TcALDH1（trans-chrysanthemal脱氢酶），并证明它们与TcCDS共表达可在异源宿主中高效合成trans-chrysanthemic acid。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Tanacetum cinerariifolium | trans-chrysanthemic acid生物合成 | TcADH2 | TcADH2 | 催化 | trans-chrysanthemol脱氢酶，氧化trans-chrysanthemol生成trans-chrysanthemal |
| Tanacetum cinerariifolium | trans-chrysanthemic acid生物合成 | TcALDH1 | TcALDH1 | 催化 | trans-chrysanthemal脱氢酶，氧化trans-chrysanthemal生成trans-chrysanthemic acid |
| Tanacetum cinerariifolium | trans-chrysanthemic acid生物合成 | TcCDS | TcCDS | 催化 | chrysanthemyl diphosphate synthase，催化DMAPP缩合生成trans-chrysanthemyl diphosphate并产生trans-chrysanthemol |
| Escherichia coli | trans-chrysanthemic acid生物合成 | TcADH2 | TcADH2 | 催化 | 重组蛋白用于体外酶活测定 |
| Escherichia coli | trans-chrysanthemic acid生物合成 | TcALDH1 | TcALDH1 | 催化 | 重组蛋白用于体外酶活测定 |
| Nicotiana benthamiana | trans-chrysanthemic acid生物合成 | TcCDS, TcADH2, TcALDH1 | TcCDS, TcADH2, TcALDH1 | 催化 | 瞬时共表达实现trans-chrysanthemic acid的异源合成 |
| Tanacetum cinerariifolium | 除虫菊酯生物合成 | TcGLIP | TcGLIP | 催化 | GDSL脂肪酶，催化酸与醇形成酯，作为共表达分析参照基因 |
关键发现
- TcADH2催化trans-chrysanthemol氧化为trans-chrysanthemal，其Km值为236.0±5.8 μM，kcat为0.75±0.0032 s⁻¹
- TcALDH1催化trans-chrysanthemal氧化为trans-chrysanthemic acid，其Km值为4.4±2.2 μM（NADP⁺）和4.6±1.8 μM（NAD⁺）。在N. benthamiana中单独表达TcCDS产生trans-chrysanthemol 18.3 nmol/g FW及痕量trans-chrysanthemic acid
- 共表达TcCDS+TcADH2使trans-chrysanthemic acid产量达328.0 nmol/g FW（较单独TcCDS提高48倍）
- 共表达TcCDS+TcADH2+TcALDH1使产量达818.4 nmol/g FW（提高122倍），总产量（含酯化形式）为1946.6 nmol/g FW，其中58.0%被糖基化或酯化修饰。
研究结论
TcADH2和TcALDH1是trans-chrysanthemic acid生物合成途径中关键的氧化还原酶，通过共表达这三个基因可在异源植物中高效合成trans-chrysanthemic acid，为除虫菊酯的代谢工程生产奠定了基础。