Golden Gate Assembly system dedicated to complex pathway manipulation in Yarrowia lipolytica
- 作者
- Ewelina Celinska, Rodrigo Ledesma-Amaro, Macarena Larroude, Tristan Rossignol, Cyrille Pauthenier, Jean-Marc Nicaud
- 单位
- Department of Biotechnology and Food Microbiology, Poznan University of Life Sciences; Micalis Institute, INRA, AgroParisTech, Université Paris-Saclay; Institute of System and Synthetic Biology, Université d'Evry vald'Essonnes
- 杂志
- Microbial Biotechnology（2017）
- DOI
- 10.1111/1751-7915.12605
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
解脂耶氏酵母缺乏高效、标准化的多基因组装平台，传统克隆方法费时费力，难以实现复杂代谢通路的快速组合克隆。
研究策略
采用Golden Gate模块化克隆策略，基于IIS型限制酶，设计13个4碱基粘性末端和对应的目的载体系统，构建可互换的标准化DNA模块，实现一个、两个或三个转录单元的快速组装，并以类胡萝卜素合成通路为模型验证系统可行性。
核心内容
本研究针对解脂耶氏酵母缺乏高效多基因组装平台的问题，建立了一套基于Golden Gate策略的模块化克隆系统。作者设计了13个预定义的4碱基粘性末端及配套目的载体，使单个或多个转录单元能够以标准化、可互换的DNA模块形式快速拼接，并引入RFP、amilCP、amilGFP等颜色标记与多种抗生素抗性基因辅助筛选。以类胡萝卜素合成通路为模型，该系统成功组装了包含13个片段的复杂构建体，转化后每反应获得超过4×10²个菌落；在JMY195菌株中约90%的转化子呈现期望的红橙色表型，显著高于此前DNA assembler策略约20%的效率。这一平台显著提升了解脂耶氏酵母中复杂代谢通路构建的标准化程度与灵活性，极大丰富了该工业微生物的合成生物学工具库，为多基因通路的快速组合克隆提供了通用且稳健的方案。
创新点
首次为解脂耶氏酵母建立了专用的Golden Gate组装标准；设计了包含13个预定义4碱基粘性末端的通用支架，可灵活组装多转录单元；引入颜色筛选标记（RFP/amilCP/amilGFP）和多种抗生素抗性基因；通过类胡萝卜素通路实现直观表型筛选。
研究对象（11）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Yarrowia lipolytica Po1d (JMY195) | 类胡萝卜素合成 | GGS1 | 香叶基香叶基二磷酸合酶 | 催化 | 内源基因，位于G1位置，催化GGPP合成 |
| Yarrowia lipolytica Po1d (JMY195) | 类胡萝卜素合成 | carB | 八氢番茄红素脱氢酶 | 催化 | 来自Mucor circinelloides的异源基因，位于G2位置 |
| Yarrowia lipolytica Po1d (JMY195) | 类胡萝卜素合成 | carRP | 八氢番茄红素合酶 | 催化 | 来自Mucor circinelloides的异源基因，位于G3位置 |
| Yarrowia lipolytica Po1d (JMY195) | 类胡萝卜素合成 | URA3 | 乳清苷酸脱羧酶 | 调控 | 作为筛选标记基因（1289 nt） |
| Yarrowia lipolytica Po1d (JMY195) | 基因组整合 | zeta序列 | — | 区室化 | 用于随机整合的靶向序列（UP 305 nt, DOWN 395 nt） |
| Yarrowia lipolytica Po1d (JMY195) | 基因表达 | TEF启动子 | — | 调控 | 每个基因侧翼的启动子片段（396 nt） |
| Yarrowia lipolytica Po1d (JMY195) | 基因表达 | Lip2终止子 | — | 调控 | 每个基因侧翼的终止子片段（122 nt） |
| Yarrowia lipolytica JMY1212 | 基因组整合 | zeta序列 | — | 区室化 | 带有leu2-270位点的zeta对接平台，实现同源重组 |
| E. coli DH5α | 克隆载体 | RFP/amilCP/amilGFP | 荧光/显色蛋白 | 调控 | 用于蓝白斑筛选的阴性选择标记 |
| Yarrowia lipolytica | 脂肪酶分泌 | LIP2 | 脂肪酶 | 催化 | LIP2位点作为整合靶点，可通过 tributyrin 平板验证 |
| Yarrowia lipolytica | 蔗糖利用 | SUC2 | 蔗糖酶 | 催化 | 来自酿酒酵母，作为ura3-320等位基因的标记，用于蔗糖平板筛选 |
关键发现
- 构建了含13个Golden Gate片段的复杂组装体，转化Y. lipolytica后每个反应可获得超过4×10^2个菌落
- 约10%为白色菌落（如50/517, 91/1052, 41/396），其余表现不同强度的橙色
- 在JMY195菌株中67%-90%的转化子呈现期望的红橙色表型（JMY1212中约67%，JMY195中约90%），显著高于此前DNA assembler策略的20%效率
- 在JMY1212中白色菌落比例更高（33/98）。
研究结论
该研究开发了一套稳健、通用的Golden Gate组装平台，显著提升了解脂耶氏酵母中复杂代谢通路构建的效率、标准化程度和灵活性，极大丰富了该工业微生物的分子生物学工具库，适用于快速组合克隆和合成生物学应用。