13C metabolic flux profiling of Pichia pastoris grown in aerobic batch cultures on glucose revealed high relative anabolic use of TCA cycle and limited incorporation of provided precursors of branched-chain amino acids
- 作者
- Meng Zhang, Xiao-Wei Yu, Yan Xu, Paula Jouhten, G. V. T. Swapna, Ralf W. Glaser, John F. Hunt, Gaetano T. Montelione, Hannu Maaheimo, Thomas Szyperski
- 单位
- School of Biotechnology and Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University; European Molecular Biology Laboratory Heidelberg; Center for Advanced Biotechnology and Medicine, Department of Molecular Biology and Biochemistry, Rutgers, The State University of New Jersey; Institute of Biochemistry and Biophysics, Friedrich-Schiller-Universität; Department of Biological Sciences, Columbia University; Department of Biochemistry and Molecular Biology, Robert Wood Johnson Medical School, Rutgers, The State University of New Jersey; VTT Technical Research Centre of Finland Ltd; Department of Chemistry, State University of New York at Buffalo
- 杂志
- FEBS Journal（2017）
- DOI
- 10.1111/febs.14180
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析巴氏毕赤酵母在葡萄糖好氧批培养条件下的中心碳代谢通量分布，并研究α-酮异戊酸、α-酮丁酸和缬氨酸的跨膜转运及其对支链氨基酸生物合成的影响，为ILV稳定同位素标记样品的制备提供代谢层面的依据。
研究策略
采用13C NMR结合生物合成定向分数标记（BDF）进行代谢通量比分析；通过向培养基中添加未标记的α-KIV、α-KB或Val的'去标记'实验，利用HSQC谱检测甲基信号体积变化来评估前体的摄取和利用；同时比较P. pastoris、P. stipitis和S. cerevisiae的通量比。
核心内容
本研究采用13C NMR结合生物合成定向分数标记技术，对巴氏毕赤酵母在葡萄糖好氧批培养条件下的中心碳代谢通量进行了定量解析，并系统考察了α-酮异戊酸、α-酮丁酸和缬氨酸的跨膜转运及其对支链氨基酸合成的影响。结果显示，该酵母的磷酸烯醇式丙酮酸来源于磷酸戊糖途径的比例上限为34%，介于P. stipitis（57%）和S. cerevisiae（0–4%）之间；线粒体草酰乙酸由丙酮酸羧化酶回补的占比为58–61%，显著高于P. stipitis的36%，表明其TCA循环厌补通量异常偏高。去标记实验揭示，添加未标记α-KIV未引起Val和Leu甲基信号的明显稀释，说明细胞缺乏该前体的有效摄取系统；而添加Val后，Val和Leu甲基的13C去标记率可达约45%–75%，证明Val能被高效转运并满足两种支链氨基酸的合成需求；α-KB虽可进入细胞和线粒体，但Ile甲基去标记率仅约10%–40%，且无法有效抑制内源合成。这些发现明确了P. pastoris在支链氨基酸前体利用上的转运瓶颈，为优化ILV稳定同位素标记蛋白样品的制备提供了代谢层面的关键靶点。
创新点
首次对巴氏毕赤酵母批培养进行基于NMR的通量比分析；发现其TCA循环的厌补通量异常高（介于两种酵母之间）；揭示P. pastoris缺乏α-KIV的有效跨膜转运系统；证明Val可被高效摄取并满足Val和Leu的合成需求；发现α-KB虽能进入细胞和线粒体，但不能有效抑制内源α-KB合成。
研究对象（18）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pichia pastoris GS115 | 中心碳代谢 | — | pyruvate carboxylase (EC 6.4.1.1) | 催化 | 催化丙酮酸羧化为草酰乙酸，参与TCA循环厌补回补 |
| Pichia pastoris GS115 | 糖异生/TCA循环 | — | PEP carboxykinase (EC 4.1.1.49) | 催化 | 催化草酰乙酸转化为PEP，在P. pastoris中该通量很低（<5%） |
| Pichia pastoris GS115 | 糖酵解 | — | pyruvate kinase (EC 2.7.1.40) | 催化 | 催化PEP转化为丙酮酸，参与细胞质草酰乙酸合成 |
| Pichia pastoris GS115 | 丙酮酸代谢 | — | malic enzyme (EC 1.1.1.39/1.1.1.40) | 催化 | 线粒体中由苹果酸合成丙酮酸，在P. pastoris中通量很低（<6%） |
| Pichia pastoris GS115 | TCA循环 | — | fumarase (EC 4.2.1.2) | 催化 | 催化延胡索酸与苹果酸可逆互变，影响草酰乙酸标记模式 |
| Pichia pastoris GS115 | 磷酸戊糖途径 | — | transketolase (EC 2.2.1.1) | 催化 | 催化F6P和G3P转化为X5P和E4P，用于估算PPP通量 |
| Pichia pastoris GS115 | 磷酸戊糖途径 | — | transaldolase (EC 2.2.1.2) | 催化 | 参与PPP非氧化阶段碳骨架重排 |
| Pichia pastoris GS115 | C1代谢 | — | serine hydroxymethyltransferase (SHMT, EC 2.1.2.1) | 催化 | 丝氨酸与甘氨酸和C1单元互变，用于评估C1代谢通量 |
| Pichia pastoris GS115 | C1代谢 | — | glycine cleavage system (GCS) | 催化 | 甘氨酸裂解为CO2和C1单元，P. pastoris中该通量约5% |
| Pichia pastoris GS115 | 支链氨基酸生物合成 | — | branched-chain-amino-acid aminotransferase (BCAT, EC 2.6.1.42) | 催化 | 位于细胞质，催化Val/Leu/Ile与对应α-酮酸之间的转氨作用 |
| Pichia pastoris GS115 | 异亮氨酸生物合成 | — | threonine dehydratase (EC 4.3.1.19) | 催化 | 催化苏氨酸转化为α-酮丁酸，是Ile合成的内源前体来源 |
| Pichia pastoris GS115 | 苏氨酸代谢 | — | threonine aldolase (EC 4.1.2.5) | 催化 | 催化苏氨酸与甘氨酸和乙醛互变，可能在稳定期发挥调节作用 |
| Pichia pastoris GS115 | 支链氨基酸生物合成 | — | acetohydroxy acid isomeroreductase (EC 1.1.1.86) | 催化 | 催化Val/Leu合成中的甲基迁移，参与立体特异性标记形成 |
| Pichia pastoris GS115 | 跨膜转运 | — | α-KIV transporter (推测存在) | 转运 | 实验未检测到α-KIV从培养基进入细胞质，表明P. pastoris缺乏有效的α-KIV跨膜转运系统 |
| Pichia pastoris GS115 | 跨膜转运 | — | α-KB transporter (线粒体/质膜) | 转运 | α-KB可进入细胞并被转运至线粒体，但转运效率较低且不能抑制内源α-KB合成 |
| Pichia pastoris GS115 | 跨膜转运 | — | Val transporter (general amino acid permease) | 转运 | Val被高效摄取，并在细胞内转化为α-KIV，同时满足Val和Leu的合成需求 |
| Pichia pastoris GS115 | 跨膜转运 | — | mitochondrial pyruvate carrier (MPC) | 转运 | 负责丙酮酸和α-酮丁酸进入线粒体，对Ile合成至关重要 |
| Pichia pastoris GS115 | 跨膜转运 | — | OAA transporter (线粒体内膜) | 转运 | 介导草酰乙酸跨线粒体内膜转运，影响TCA循环的区室化通量 |
关键发现
- 在葡萄糖好氧批培养中，P. pastoris的PEP来源于磷酸戊糖途径的上限为34%（P. stipitis为57%，S. cerevisiae为0-4%）
- 线粒体草酰乙酸由丙酮酸羧化酶回补的占比为58-61%（P. stipitis为36%，S. cerevisiae为76%）
- 添加未标记α-KIV（0.1-1 g/L）未检测到Val和Leu的标记降低，表明α-KIV不能被细胞摄取
- 添加Val后，GV-2培养物中Val甲基13C去标记率约45%，GV-3约75%，Leu甲基去标记率类似，表明Val被高效摄取并用于Val和Leu合成
- 添加α-KB后，GB-2中Ile δ1甲基13C去标记率约10%，GB-3约40%，GBI系列中α-KB用于Ile合成的比例约15%
- 添加Val或α-KB不影响中心碳代谢通量比（与仅葡萄糖的G-2相比，各比值变化不大）
- 在培养基中添加Val或α-KB后，7小时和15小时时分别约有10%和40-50%的Val/α-KB被细胞消耗。
研究结论
巴氏毕赤酵母在葡萄糖批培养中的中心碳代谢调控与P. stipitis和S. cerevisiae均存在显著差异，其TCA循环的高回补通量在Crabtree阴性酵母中出乎意料。支链氨基酸前体的转运研究表明：α-KIV缺乏有效的跨膜转运体，而Val可高效摄取并转化为α-KIV满足Val和Leu需求；α-KB虽可进入线粒体但摄取效率低，且不能抑制内源合成。这些瓶颈为优化P. pastoris中ILV标记蛋白样品制备提供了明确靶点。