Functional analysis of Pogostemon cablin farnesyl pyrophosphate synthase gene and itsbinding transcription factor PcWRKY44 in regulating biosynthesis of patchouli alcohol
- 作者
- Xiaobing Wang, Yun Tang, Huiling Huang, Daidi Wu, Xiuzhen Chen, Junren Li, Hai Zheng, Ruoting Zhan, Likai Chen
- 单位
- Research Center of Chinese Herbal Resource Science and Engineering, Guangzhou University of Chinese Medicine; Key Laboratory of Chinese Medicinal Resource From Lingnan (Guangzhou University of Chinese Medicine), Ministry of Education; Joint Laboratory of National Engineering Research Center for the Pharmaceutics of Traditional Chinese Medicines; College of Agriculture and Biology, Zhongkai University of Agriculture and Engineering; Affiliated Cancer Hospital and Institute of Guangzhou Medical University; Guangdong Food and Drug Vocational College; Maoming Branch, Guangdong Laboratory for Lingnan Modern Agriculture
- 杂志
- Frontiers in Plant Science（2022）
- DOI
- 10.3389/fpls.2022.946629
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
广藿香中法尼基焦磷酸合酶（PcFPPS）及其结合转录因子PcWRKY44在广藿香醇生物合成中的功能与分子调控机制尚不清楚。
研究策略
克隆并表征PcFPPS基因，通过亚细胞定位、酵母功能互补、广藿香瞬时过表达、烟草稳定转化、双荧光素酶报告系统、酵母单杂交等实验，系统解析PcFPPS的酶学功能及PcWRKY44对其的转录调控作用。
核心内容
该研究系统解析了广藿香中法尼基焦磷酸合酶基因PcFPPS及其上游转录因子PcWRKY44在广藿香醇生物合成中的功能与调控机制。研究首先克隆并鉴定了PcFPPS基因，其开放阅读框长1050 bp，编码349个氨基酸，蛋白定位于细胞质；酵母功能互补实验证实该酶具有生物活性。在广藿香叶片中瞬时过表达PcFPPS使广藿香醇含量从1.47 mg/g提高至2.16 mg/g，增幅约47%；在转基因烟草中，OEL4品系的FPP酶活性为野生型的1.7倍，植醇、新植二烯和豆甾醇含量最高分别提升1.85倍、1.76倍和1.73倍。进一步研究发现，核定位转录因子PcWRKY44可直接结合PcFPPS启动子中220 bp区域并激活其表达，瞬时过表达PcWRKY44使广藿香醇含量提高12.3%，同时上调PcFPPS和PcPTS表达。该研究首次阐明了PcWRKY44-PcFPPS的转录调控模块，为广藿香醇的基因工程高产提供了关键靶点。
创新点
首次系统验证了PcFPPS在广藿香醇合成中的关键作用，并发现核定位转录因子PcWRKY44可直接结合PcFPPS启动子220bp区域并激活其表达，从而促进广藿香醇积累，阐明了新的转录调控网络。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pogostemon cablin (广藿香) | 甲羟戊酸（MVA）途径/萜类生物合成 | PcFPPS | PcFPPS | 催化 | 法尼基焦磷酸合酶，催化DMAPP与IPP缩合生成FPP，为广藿香醇提供前体 |
| Saccharomyces cerevisiae CC25 | 甾醇生物合成 | PcFPPS | PcFPPS | 催化 | 功能性互补CC25菌株的FPPS缺失突变，恢复其在高温下的生长 |
| Nicotiana tabacum (烟草K326) | 萜类生物合成 | PcFPPS | PcFPPS | 催化 | 异源过表达显著提高FPP酶活性，增加植醇、新植二烯和豆甾醇等萜类代谢物积累 |
| Pogostemon cablin (广藿香) | 广藿香醇生物合成 | PcWRKY44 | PcWRKY44 | 调控 | WRKY转录因子，定位于细胞核，直接结合PcFPPS启动子220bp区域并激活其转录，同时上调PcPTS表达 |
| Pogostemon cablin (广藿香) | 广藿香醇生物合成 | PcPTS | PcPTS | 催化 | 广藿香醇合酶，催化FPP生成广藿香醇，受PcWRKY44过表达上调 |
关键发现
- PcFPPS基因开放阅读框长1050 bp，编码349个氨基酸，蛋白分子量40.11 kDa，定位于细胞质
- 酵母功能互补实验证明PcFPPS具有生物活性
- 在广藿香叶片中瞬时过表达PcFPPS使广藿香醇含量增加约47%（从1.47 mg/g提高到2.16 mg/g）
- 在转基因烟草中FPP酶活性显著上调，其中OEL4品系酶活性为野生型的1.7倍，植醇、新植二烯和豆甾醇含量最高分别提高1.85倍、1.76倍和1.73倍
- PcWRKY44定位于细胞核，能结合220bp的PcFPPS启动子区
- 瞬时过表达PcWRKY44使广藿香醇含量比对照提高12.3%（1.19 mg/g FW vs 1.06 mg/g FW），同时上调PcFPPS和PcPTS表达。
研究结论
PcFPPS是广藿香醇生物合成的正调控关键酶，PcWRKY44作为其上游转录因子通过结合启动子激活PcFPPS表达并协同上调PcPTS，共同促进广藿香醇积累，为广藿香醇的基因工程生产提供了重要靶点。