Functional characterization and transcriptional activity analysis of Dryopteris fragrans farnesyl diphosphate synthase genes
- 作者
- Dongrui Zhang, Xun Tang, Lingling Chen, Xiaojie Qiu, Chunhua Song, Hemeng Wang, Ying Chang
- 单位
- College of Life Sciences, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China; MOA Key Laboratory of Crop Ecophysiology and Farming System in the Middle Reaches of the Yangtze River, College of Plant Science & Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China
- 杂志
- Frontiers in Plant Science（2023）
- DOI
- 10.3389/fpls.2023.1105240
- 所属领域
- 植物代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
对香鳞毛蕨（Dryopteris fragrans）中两个法尼基二磷酸合酶基因（DfFPS1和DfFPS2）进行克隆、功能鉴定及启动子转录活性分析，以揭示其在萜类代谢和逆境响应中的作用。
研究策略
采用生物信息学分析、体外酶活性测定、亚细胞定位、转基因烟草过表达、FPNI-PCR启动子克隆及GUS报告基因缺失分析等策略。
核心内容
本研究从香鳞毛蕨中克隆并功能鉴定了两个法尼基二磷酸合酶基因DfFPS1和DfFPS2。两者开放阅读框分别为1041 bp和1065 bp，编码蛋白定位于细胞质，体外实验证实均具备催化FPP合成的活性。表达分析显示两基因受茉莉酸甲酯、高温和干旱胁迫显著诱导，其中DfFPS1在MeJA处理24小时时表达量达到初始的11.47倍，高温处理6小时为11.25倍。在转基因烟草中，过表达DfFPS1使尼古丁含量提升至野生型的3.12倍，DfFPS2则显著提高了多种二萜类化合物含量，同时赋予植株高温和干旱耐受性。启动子缺失分析确定proDfFPS1的转录核心区域位于-943至-740 bp之间，且启动子在气孔中具有高表达活性。研究还优化了FPNI-PCR技术用于无参考基因组物种的启动子克隆。这些结果揭示了DfFPS基因在蕨类萜类代谢及逆境响应中的关键作用，为利用其启动子和基因资源改良作物抗逆性与萜类产量提供了理论依据。
创新点
首次报道FPS过表达赋予转基因烟草高温和干旱抗性；发现DfFPS基因启动子在气孔中高表达；优化了FPNI-PCR用于无参考基因组物种的启动子克隆。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 大肠杆菌BL21(DE3) | 萜类代谢 | DfFPS1 | 法尼基二磷酸合酶1（DfFPS1） | 催化 | 体外表达并纯化，验证催化FPP合成 |
| 大肠杆菌BL21(DE3) | 萜类代谢 | DfFPS2 | 法尼基二磷酸合酶2（DfFPS2） | 催化 | 体外表达并纯化，验证催化FPP合成 |
| 烟草（Nicotiana tabacum） | 萜类代谢 | DfFPS1 | DfFPS1 | 催化 | 过表达后促进萜类次生代谢物积累 |
| 烟草（Nicotiana tabacum） | 萜类代谢 | DfFPS2 | DfFPS2 | 催化 | 过表达后促进萜类次生代谢物积累 |
| 拟南芥原生质体 | 萜类代谢 | DfFPS1 | DfFPS1 | 催化 | 亚细胞定位于细胞质 |
| 拟南芥原生质体 | 萜类代谢 | DfFPS2 | DfFPS2 | 催化 | 亚细胞定位于细胞质 |
| 烟草叶片（瞬时转化） | 萜类代谢 | proDfFPS1 | — | 调控 | 启动子驱动GUS报告基因，转录核心区在-943~-740 bp |
| 烟草叶片（瞬时转化） | 萜类代谢 | proDfFPS2 | — | 调控 | 启动子驱动GUS报告基因，活性较低 |
关键发现
- DfFPS1和DfFPS2的ORF分别为1041 bp和1065 bp，编码346 aa（39.87 kDa）和354 aa（40.67 kDa）的蛋白，核苷酸和氨基酸一致性分别为84.23%和86.72%
- 两者均定位于细胞质并能体外催化FPP合成。表达分析显示DfFPS1在MeJA处理后24h表达量达到0h的11.47倍，DfFPS2在6h为3.48倍
- 高温胁迫下DfFPS1在6h达到11.25倍，DfFPS2在12h为3.98倍
- PEG处理后DfFPS1在1.5h为5.51倍。转基因烟草中，35S::DfFPS1的尼古丁含量为野生型的3.12倍，新植二烯为1.47倍
- 35S::DfFPS2的cis-7,10,13,16,19-二十二碳五烯酸甲酯、manool、香叶基芳樟醇、二十碳五烯酸乙酯含量分别为野生型的1.62、2.47、3.18和1.87倍。启动子缺失分析表明proDfFPS1的转录核心区域位于-943至-740 bp之间。
研究结论
DfFPS1和DfFPS2是香鳞毛蕨萜类代谢的关键酶，参与应对激素和逆境胁迫，过表达可增加烟草萜类产量并提高高温/干旱抗性；启动子分析揭示其表达调控机制，为蕨类萜类代谢调控提供了基础。