Type 2 isopentenyl diphosphate isomerase from a thermoadiphiclarchaeon Sulfolobus shibatae
- 作者
- Satoshi Yamashita, Hisashi Hemmi, Yosuke Ikeda, Toru Nakayama, Tokuzo Nishino
- 单位
- Department of Biomolecular Engineering, Graduate School of Engineering, Tohoku University, Miyagi, Japan
- 杂志
- European Journal of Biochemistry（2004）
- DOI
- 10.1111/j.1432-1033.2004.04010.x
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
古菌利用甲羟戊酸途径合成类异戊二烯，但一直未检测到IPP异构酶活性，且基因组中缺乏已知type 1异构酶同源基因；需鉴定古菌中负责IPP/DMAPP互变的酶。
研究策略
以Sulfolobus acidocaldarius中fni同源ORF3为探针，从Sulfolobus shibatae基因组文库克隆idi基因，在大肠杆菌中异源表达并纯化重组IDI；制备脱辅基酶研究FMN依赖性；通过分光光度法测定NADH消耗和过氧化氢生成，表征其NADH脱氢酶活性。
核心内容
本研究首次从嗜热古菌Sulfolobus shibatae中克隆并表征了type 2异戊烯基二磷酸异构酶（IDI）。以Sulfolobus acidocaldarius的fni同源ORF3为探针，从基因组文库中获取idi基因，其编码368个氨基酸，与ORF3有62%同一性。重组蛋白在大肠杆菌中表达纯化后为四聚体，分子量约180 kDa，最适pH 6.0、最适温度80°C，70°C处理1小时仍保留83%活性。酶活性依赖Mg²⁺和NAD(P)H，对IPP的Km为63 μM，kcat为0.2 s⁻¹。脱辅基实验证实每个单体含0.9 mol FMN，加入5 μM FMN可恢复98%活性，FMN解离常数为0.319 μM。值得注意的是，该酶同时具有NADH脱氢酶活性，但异构酶反应本身不消耗NADH，且IPP和Mg²⁺可抑制此脱氢酶活性，反应伴随过氧化氢生成。这一发现首次证实古菌中存在type 2 IPP异构酶，揭示FMNH₂在催化中起关键作用，为理解古菌类异戊二烯生物合成途径及type 2 IDI的催化机制提供了重要基础。
创新点
['首次从古菌中克隆并表征了type 2 IPP异构酶', '通过脱辅基酶实验证实该酶对FMN的严格依赖性', '首次发现type 2 IPP异构酶具有NADH脱氢酶活性，且异构酶反应不消耗NADH']
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Sulfolobus shibatae | 类异戊二烯生物合成（甲羟戊酸途径） | idi | IDI (type 2 IPP isomerase) | 催化 | 古菌来源的type 2 IPP异构酶，四聚体，依赖FMN和NAD(P)H，具有NADH脱氢酶活性。 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 异源表达 | idi (重组pET-idi) | His-tagged IDI | 催化 | 用于异源表达和纯化重组酶。 |
| Sulfolobus acidocaldarius | 类异戊二烯生物合成 | gds | GGPP synthase | 催化 | 用于偶联检测IDI催化产生的DMAPP。 |
关键发现
- 从Sulfolobus shibatae克隆的idi基因长1107 bp，编码368个氨基酸（与ORF3有62%同一性）。重组IDI为四聚体，分子量约180 kDa（单体约40 kDa，理论分子量42.5 kDa）。最适pH 6.0，最适温度80°C，70°C处理1 h后保留83%活性。酶活性依赖Mg2+和NAD(P)H，NAD+无活性
- 解离常数Mg2+为0.31±0.05 mM，NADPH为23.8±3.9 μM，NADH为90.4±7.6 μM
- 对IPP的Km为63 μM，kcat为0.2 s−1。每个单体含0.9 mol FMN
- 脱辅基酶丧失活性，加入5 μM FMN可恢复98%活性
- FMN解离常数为0.319±0.026 μM，FAD为4.50±1.60 μM，核黄素不结合。在标准异构酶反应中消耗1.25 nmol NADH，而不含IPP和Mg2+时消耗8 nmol NADH
- NADH脱氢酶反应的Km(NADH)为87.4±5.8 μM
- 反应伴随过氧化氢产生。
研究结论
本研究首次证实古菌含有type 2 IPP异构酶，该酶为FMN和NAD(P)H依赖的黄素蛋白，并具有NADH脱氢酶活性。异构酶反应本身不消耗NADH，推测FMNH2在催化中起关键作用，底物IPP和Mg2+可抑制NADH脱氢酶活性。研究结果为理解古菌类异戊二烯生物合成及type 2 IPP异构酶的催化机制提供了基础。