Methyl jasmonate and miconazole differently affect artemisinin production and gene expression in Artemisia annua suspension cultures
- 作者
- S. Caretto, A. Quarta, M. Durante, R. Nisi, A. De Paolis, F. Blando, G. Mita
- 单位
- Istituto di Scienze delle Produzioni Alimentari, CNR, Lecce, Italy
- 杂志
- Plant Biology（2009）
- DOI
- 10.1111/j.1438-8677.2009.00306.x
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
探究青蒿素在黄花蒿悬浮细胞中的生物合成调控，比较茉莉酸甲酯（MeJA）和咪康唑对青蒿素产量及生物合成基因表达的不同影响。
研究策略
建立黄花蒿悬浮细胞培养体系，分别用22 μM MeJA和不同浓度咪康唑处理，测定青蒿素含量（HPLC）和细胞活力，并通过实时定量PCR分析关键生物合成基因（ADS、CYP71AV1、CPR、DBR2）的转录水平变化。
核心内容
该研究利用黄花蒿悬浮细胞培养体系，系统比较了茉莉酸甲酯（MeJA）和咪康唑对青蒿素生物合成的差异化调控作用。通过建立稳定的悬浮培养体系，研究分别以22 μM MeJA和不同浓度咪康唑处理细胞，采用HPLC测定青蒿素含量，并结合实时定量PCR分析关键生物合成基因ADS、CYP71AV1、CPR和DBR2的转录变化。结果显示悬浮细胞在整个传代周期内持续产生青蒿素（4.90–5.44 μg·g⁻¹ DW），且可释放至培养基。MeJA处理30 min使青蒿素产量由5.94 μg·g⁻¹ DW提升至12.44 μg·g⁻¹ DW（约2.1倍），4 h达到峰值14.40 μg·g⁻¹ DW，同期CYP71AV1转录上调7倍，细胞活力保持约85%。咪康唑处理5天使青蒿素达13.04 μg·g⁻¹ DW（约2.5倍），但30 min即导致细胞活力下降40%，且其作用与CPR和DBR2上调相关，CYP71AV1则不受显著影响，ADS在悬浮细胞中始终未检测到表达。这些结果表明MeJA通过快速上调CYP71AV1刺激青蒿素合成，而咪康唑的作用可能涉及非转录机制，CYP71AV1可作为代谢工程改造的候选靶点。
创新点
首次在黄花蒿悬浮细胞中系统比较MeJA和咪康唑对青蒿素合成的差异化调控；发现MeJA快速诱导青蒿素积累并上调CYP71AV1，而咪康唑上调CPR和DBR2但对细胞活力有严重影响；并发现青蒿素可释放到培养基中。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Artemisia annua悬浮细胞 | 青蒿素生物合成途径 | ADS | amorpha-4,11-diene合酶 | 催化 | 催化法呢基二磷酸环化为amorpha-4,11-diene；在悬浮细胞中未能检测到表达（可能组织特异性） |
| Artemisia annua悬浮细胞 | 青蒿素生物合成途径 | CYP71AV1 | 细胞色素P450单加氧酶 | 催化 | 催化amorpha-4,11-diene三步氧化为青蒿酸；被MeJA显著上调（30 min约7倍） |
| Artemisia annua悬浮细胞 | 青蒿素生物合成途径 | CPR | 细胞色素P450还原酶 | 催化 | 为CYP71AV1提供电子；被咪康唑上调（4 h >3倍），MeJA无显著影响 |
| Artemisia annua悬浮细胞 | 青蒿素生物合成途径 | DBR2 | 青蒿醛Δ11(13)还原酶 | 催化 | 催化青蒿醛还原；被咪康唑上调（30 min约4倍，4 h约3倍） |
| Artemisia annua悬浮细胞 | 茉莉酸信号通路 | LOX3 | 脂氧合酶 | 催化 | 作为MeJA诱导的阳性对照基因（A. annua EST EY075668） |
关键发现
- 黄花蒿悬浮培养细胞在整个传代周期内持续产生青蒿素（4.90–5.44 μg·g⁻¹ DW），并可释放到培养基中（最高15.35 μg·L⁻¹）。22 μM MeJA处理30 min使青蒿素产量从对照组5.94 μg·g⁻¹ DW增至12.44 μg·g⁻¹ DW（约2.1倍），4 h处理达到最高14.40 μg·g⁻¹ DW（约2.4倍），5天后回落至对照水平
- 细胞活力在5天处理下仍保持约85%。200 μM咪康唑处理24 h使青蒿素显著增加，处理5天达到最高13.04 μg·g⁻¹ DW（约2.5倍），但30 min即导致细胞活力下降40%
- 100 μM和10 μM效果较弱或无效。基因表达方面，MeJA处理30 min使CYP71AV1转录水平上调7倍，且其表达时程与青蒿素积累相关
- 咪康唑处理4 h使CPR上调3倍以上，30 min和4 h使DBR2分别上调约4倍和3倍，而CYP71AV1表达不受显著影响。ADS基因在悬浮细胞中始终无法检测到表达。
研究结论
黄花蒿悬浮细胞培养体系是研究青蒿素生物合成调控的有效工具。MeJA通过快速上调CYP71AV1基因表达刺激青蒿素合成，而咪康唑诱导青蒿素积累与CPR和DBR2的上调相关，但可能涉及非转录机制或ROS介导的自发氧化转化。CYP71AV1可作为代谢工程改造以提高青蒿素产量的候选靶点。