Positioning Bacillus subtilis as terpenoid cell factory
- 作者
- H. Pramastya, Y. Song, E.Y. Elfahmi, S. Sukrasno, W.J. Quax
- 单位
- University of Groningen, Groningen, The Netherlands; Pharmaceutical Biology Research Group, School of Pharmacy, Institut Teknologi Bandung, Bandung, Indonesia
- 杂志
- Journal of Applied Microbiology（2021）
- DOI
- 10.1111/jam.14904
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
将枯草芽孢杆菌开发为高效的萜类化合物细胞工厂，系统总结其内源MEP途径的酶学特性、萜类合酶表达及代谢工程策略。
研究策略
综述MEP途径各酶的结构与功能、异源萜类合酶在B. subtilis中的表达、代谢工程改造（基因过表达、模块化工程、辅因子再生等）以及现有遗传工具。
核心内容
该综述系统评估了将枯草芽孢杆菌开发为萜类化合物细胞工厂的潜力，重点梳理了其内源MEP途径各酶的生化特性与工程改造策略。作者比较了枯草芽孢杆菌与大肠杆菌、酿酒酵母作为宿主的优劣，指出其GRAS安全状态、异戊二烯高释放能力及MEP途径若干酶的特殊优势，如IspD催化效率约为大肠杆菌同源酶的2倍，IspF与MEP形成复合物后催化效率提高4至8倍。通过过表达dxs、模块化工程和辅因子再生等手段，多种萜类产品已获显著提升：C30类胡萝卜素达910 mg/g干重，紫杉二烯产量17.8 mg/L，超过酵母体系；青蒿二烯经MEP全通路与IspA过表达后达42.5 mg/L，而利用Phr60-Rap60-Spo0A群体感应动态开关使维生素K2产量从69.5 mg/L跃升至360 mg/L。蛋白工程方面，ADS双突变体和LPS突变体分别使催化效率提高4倍和10倍。这些结果说明，结合内源途径强化、异源合酶表达与动态调控工具，枯草芽孢杆菌具备成为工业萜类生产平台的现实条件。
创新点
系统比较了B. subtilis与E. coli、S. cerevisiae作为萜类细胞工厂的优劣；总结了B. subtilis MEP途径酶的特殊性质（如Dxs对反馈抑制更耐受、IspD催化效率更高）；回顾了近年在类胡萝卜素、无萜二烯、紫杉二烯、维生素K2等萜类生产上的工程进展，包括利用动态调控开关实现最高产量。
研究对象（22）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Bacillus subtilis | MEP pathway | dxs | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶 (Dxs) | 催化 | MEP途径第1步，限速酶，受IDP/DMADP反馈抑制，B. subtilis Dxs更耐受 |
| Bacillus subtilis | MEP pathway | dxr/ispC | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶 (Dxr/IspC) | 催化 | MEP途径第2步，过表达dxr对异戊二烯无改善但有利于类胡萝卜素 |
| Bacillus subtilis | MEP pathway | ispD | 4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓醇合酶 (IspD) | 催化 | 催化效率比E. coli高约2倍，接触溶剂面积更小 |
| Bacillus subtilis | MEP pathway | ispE | 4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶 (IspE) | 催化 | 磷酸化CDP-ME，反应通量较高 |
| Bacillus subtilis | MEP pathway | ispF | 2-C-甲基-D-赤藓醇2,4-环二磷酸合酶 (IspF) | 催化 | 受MEP正反馈激活，被FDP等异戊烯基焦磷酸抑制 |
| Bacillus subtilis | MEP pathway | ispG | 1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸合酶 (IspG) | 催化 | Fe-S簇蛋白，将MECDP转化为HMBDP |
| Bacillus subtilis | MEP pathway | ispH | 1-羟基-2-甲基-丁烯基-4-二磷酸还原酶 (IspH) | 催化 | 末端还原酶生成IDP/DMADP，具有混杂活性 |
| Bacillus subtilis | 萜类前体异构化 | idi | 异戊烯基二磷酸异构酶 (Idi) | 催化 | B. subtilis为II型，需FMN和NADPH |
| Bacillus subtilis | 萜类前体缩合 | ispA | 法尼基二磷酸合酶 (IspA) | 催化 | 生成FDP，为倍半萜前体 |
| Bacillus subtilis | C30类胡萝卜素生物合成 | crtM | 角鲨烯合酶 (CrtM) | 催化 | 来自金黄色葡萄球菌，合成C30类胡萝卜素 |
| Bacillus subtilis | C30类胡萝卜素生物合成 | crtN | 脱氢酶 (CrtN) | 催化 | 来自金黄色葡萄球菌，与crtM共同合成C30类胡萝卜素 |
| Bacillus subtilis | 异戊二烯合成 | klspS | 异戊二烯合酶 (IspS) | 催化 | 来自野葛，异源表达提高异戊二烯产量 |
| Bacillus subtilis | 倍半萜生物合成 (amorphadiene) | ADS | 无萜二烯合酶 (ADS) | 催化 | N端修饰（融合GFP或精氨酸标签）提高表达 |
| Bacillus subtilis | 二萜生物合成 (taxadiene) | TXS | 紫杉二烯合酶 (TXS) | 催化 | 异源表达，与crtE和MEP过表达联用 |
| Bacillus subtilis | 二萜前体合成 | crtE | 牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶 (GGDPS) | 催化 | 来自菠萝泛菌，补足GGDP合成能力 |
| Bacillus subtilis | Menaquinone-7 (MK-7) 生物合成 | menA | 1,4-二羟基-2-萘甲酸异戊烯基转移酶 (MenA) | 催化 | MK-7途径关键酶，过表达提高MK-7产量 |
| Bacillus subtilis | 甘油代谢途径 | glpD | 甘油-3-磷酸脱氢酶 (GlpD) | 催化 | 增强甘油代谢，为MK-7提供更多前体 |
| Bacillus subtilis | 莽草酸途径 | dhbB | 异分支酸酶 (DhbB) | 催化 | 敲除以减少分支酸消耗，提升MK-7产量 |
| Bacillus subtilis | 群体感应调控系统 | phr60-rap60-spo0A | Phr60-Rap60-Spo0A 分子开关 | 调控 | 动态调控MK-7合成途径，无需诱导剂，产量达360 mg/L |
| Bacillus subtilis | 细胞色素P450氧化 (萜类修饰) | cyp109B1 | CYP109B1 | 催化 | 可氧化缬草烯生成圆柚酮 |
| Bacillus subtilis | 细胞色素P450氧化 (萜类修饰) | cyp102A1 | CYP102A1 (P450BM3) | 催化 | 工程化突变体可氧化amorphadiene为环氧化物 |
| Bacillus subtilis | 磷酸戊糖途径 (NADPH供应) | zwf | 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 (Zwf) | 能量供给 | 过表达可增加NADPH供给，文中提及用于其他产物但策略适用于B. subtilis |
关键发现
- 包含具体数字：过表达dxs提高异戊二烯释放
- B. subtilis IspD催化效率比E. coli高约2倍
- IspF与MEP复合时催化效率提高4-8倍
- C30类胡萝卜素产量可达910 mg/g dw（提高15倍以上）
- 用全MEP过表达后产量进一步增至约20 mg/g dcw
- amorphadiene在摇瓶可达20 mg/L，经MEP全通路和IspA过表达后达42.5 mg/L，培养基优化后达416 mg/L（待发表）
- taxadiene产量17.8 mg/L（超过酵母的8.7 mg/L）
- MK-7在模块化工程后产量达69.5 mg/L，利用Phr60-Rap60-Spo0A群体感应分子开关进一步提高到360 mg/L
- ADS双突变体（T399S/H448A）催化效率提高4倍，生产amorphadiene提高3倍
- LPS突变体M593I提高3.7倍，M593I/Y700F提高10倍
- P450BM3四突变体可转化amorphadiene至环氧化物250 mg/L
- 异源MVA途径在E. coli中amorphadiene产量达700 mg/L（摇瓶）和29 g/L（补料分批）。
研究结论
B. subtilis凭借GRAS安全状态、内源MEP途径及异戊二烯高释放能力，通过代谢工程和合成生物学工具（启动子、RBS、CRISPR等）已成功生产多种萜类化合物，并展现出成为工业萜类细胞工厂的巨大潜力，未来可通过蛋白工程、辅因子工程和动态调控进一步提升。