Enhanced (S)-linalool production by fusion expression of farnesyl diphosphate synthase and linalool synthase in Saccharomyces cerevisiae
- 作者
- Yu Deng, Mingxue Sun, Sha Xu, Jingwen Zhou
- 单位
- 国家粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江南大学，无锡，江苏，中国；工业生物技术教育部重点实验室和生物工程学院，江南大学，无锡，江苏，中国；食品安全与营养协同创新中心，无锡，江苏，中国
- 杂志
- Journal of Applied Microbiology（2016）
- DOI
- 10.1111/jam.13105
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
提高酿酒酵母甲羟戊酸途径中香叶基焦磷酸(GPP)的可利用性，以增强(S)-沉香醇的产量
研究策略
将法尼基焦磷酸合酶（FPPS，ERG20突变体）与(S)-沉香醇合酶（AaLS1）通过不同长度的柔性肽链接头融合表达，将代谢流从GPP导向(S)-沉香醇生产
核心内容
本研究在酿酒酵母中通过融合表达策略提高(S)-沉香醇产量。作者将甲羟戊酸途径中法尼基焦磷酸合酶突变体ERG20K197E与来源于 Actinidia arguta 的(S)-沉香醇合酶AaLS1通过不同长度的柔性肽链（GGGGS）n 进行融合，并考察了融合方向对产物合成的影响。结果显示，单独表达AaLS1的菌株产量为59.85±4.05 μg/L，是表达另一种沉香醇合酶ApLS1菌株的3倍。采用最优的（GGGGS）3长柔性接头将AaLS1与ERG20K197E融合后，产量进一步提高至101.55±2.97 μg/L，较游离共表达提高69.7%，表明融合蛋白实现了底物通道化，促进了香叶基焦磷酸向沉香醇的定向转化。在3L发酵罐中产量达到240.64±5.31 μg/L，较游离酶菌株提高69.1%。此外，优化二价阳离子条件后产量为134.23±6.32 μg/L，较普通培养基提高32.2%。该工作证实了融合表达途径连续酶策略在萜类产物合成中的有效性，为以香叶基焦磷酸为前体的高附加值化合物微生物生产提供了可行思路。
创新点
采用融合蛋白策略，优化肽链接头的长度和融合方向（LIS-FPPS vs FPPS-LIS），实现底物通道化，提高GPP向(S)-沉香醇的转化效率
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 酿酒酵母CEN.PK2 (Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2) | 甲羟戊酸通路（mevalonate pathway） | AaLS1 | (S)-沉香醇合酶（(S)-linalool synthase, AaLS1） | 催化 | 来源于Actinidia arguta，催化GPP生成(S)-linalool |
| 酿酒酵母CEN.PK2 (Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2) | 甲羟戊酸通路（mevalonate pathway） | ERG20^{K197E} | 法尼基焦磷酸合酶突变体（FPPS K197E） | 催化 | K197E突变使FPPS优先产生GPP而非FPP |
| 酿酒酵母CEN.PK2 (Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2) | 甲羟戊酸通路（mevalonate pathway） | ApLS1 | (S)-沉香醇合酶（ApLS1） | 催化 | 来源于Actinidia polygama，用于比较，产量低于AaLS1 |
关键发现
- 表达AaLS1的菌株产量为59.85±4.05 μg/L，是表达ApLS1菌株的3倍
- 使用最优长柔性接头(GGGGS)3融合蛋白（AaLS1-LF-ERG20K197E）产量达101.55±2.97 μg/L，比游离酶表达提高69.7%
- 在3L发酵罐中产量进一步达240.64±5.31 μg/L，比游离LIS菌株高69.1%
- 优化二价阳离子条件后产量为134.23±6.32 μg/L（比普通YNB培养基提高32.2%）
研究结论
融合表达催化甲羟戊酸途径中连续步骤的酶可显著提高以GPP为前体的(S)-沉香醇产量，获得了迄今报道的最高(S)-沉香醇产量