Co-expression of peppermint geranyl diphosphate synthase small subunit enhances monoterpene production in transgenic tobacco plants
- 作者
- Jun-Lin Yin, Woon-Seng Wong, In-Cheol Jang, Nam-Hai Chua
- 单位
- Temasek Life Sciences Laboratory, 1 Research Link, National University of Singapore, Singapore 117604, Singapore; Laboratory of Plant Molecular Biology, The Rockefeller University, 1230 York Avenue, New York, NY 10065, USA
- 杂志
- New Phytologist（2016）
- DOI
- 10.1111/nph.14280
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何在转基因烟草中有效提高单萜产量，克服传统单基因表达产量低的问题
研究策略
在烟草中共表达外源单萜合酶与薄荷香叶基二磷酸合酶小亚基（MpGPS.SSU），通过增强GPP供应提高单萜产量，并利用本氏烟草瞬时表达和烟草稳定表达系统验证效果
核心内容
本研究在转基因烟草中通过共表达薄荷香叶基二磷酸合酶小亚基（MpGPS.SSU）与多种外源单萜合酶，系统考察了增强GPP前体供应对单萜产量的影响。在本氏烟草瞬时表达体系中，共表达MpGPS.SSU使(−)-柠檬烯产量从0.23±0.05提高至7.52±1.55 μg/g FW/24h，提升约22–35倍，α-蒎烯、月桂烯、β-蒎烯及(−)-芳樟醇产量亦有2–5倍不等的显著增幅。在稳定转化烟草中，共表达MpGPS.SSU的柠檬烯产量达24.33–29.27 μg/g FW/24h，较仅表达合酶的株系提高4–8倍，芳樟醇、蒎烯和月桂烯分别提高6–19倍、2–48倍和2–14倍。体外实验表明MpGPS.SSU以剂量依赖方式使GPP产量最高提升4.5倍。与以往AmGPS.SSU不同，该小亚基通过增强GPS活性而不干扰GGPP合成，避免了矮化与褪绿等负面表型，反而促进植株生长、早花和分枝，并伴随GA3和细胞分裂素含量升高及MEP途径多个基因转录上调。结果表明MpGPS.SSU是提高植物单萜产量的有效工具，也为新单萜合酶的功能鉴定提供了可行策略。
创新点
发现MpGPS.SSU作为“加速器”而非“修饰器”增强GPS活性而不干扰GGPP合成，避免了以往GPS.SSU（如AmGPS.SSU）导致的矮化、褪绿等负面表型；同时促进了植株生长、早花和分枝
研究对象（12）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 烟草（Nicotiana tabacum） | 单萜生物合成（MEP途径） | MpGPS.SSU | geranyl diphosphate synthase small subunit | 调控 | 来自薄荷，作为异源二聚体GPS小亚基，增强GPS活性，不影响GGPPS活性，起加速器作用 |
| 烟草（Nicotiana tabacum） | 单萜生物合成 | PaLimS | (-)-limonene synthase | 催化 | 来自欧洲云杉（Picea abies），催化生成(-)-柠檬烯 |
| 烟草（Nicotiana tabacum） | 单萜生物合成 | PaLinS | (-)-linalool synthase | 催化 | 来自欧洲云杉，催化生成(-)-芳樟醇 |
| 烟草（Nicotiana tabacum） | 单萜生物合成 | PsPinS | (-)-pinene synthase | 催化 | 来自西特卡云杉（Picea sitchensis），催化生成(-)-α-蒎烯和β-蒎烯 |
| 烟草（Nicotiana tabacum） | 单萜生物合成 | PaMyrS | myrcene synthase | 催化 | 来自欧洲云杉，催化生成月桂烯 |
| 本氏烟草（Nicotiana benthamiana） | MEP途径 | SIDXS | 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase | 催化 | 来自番茄，与单萜合酶共表达未显著提高单萜产量 |
| 本氏烟草（Nicotiana benthamiana） | 萜类前体合成 | AtGPS | geranyl diphosphate synthase 1 | 催化 | 来自拟南芥，共表达未显著提高单萜产量，可能主要催化长链前体 |
| 烟草（Nicotiana tabacum） | MEP途径 | DXS | 1-deoxyxylulose-5-phosphate synthase | 催化 | 内源MEP途径关键酶，在MpGPS.SSU过表达株系中转录水平上调 |
| 烟草（Nicotiana tabacum） | MEP途径 | HDR | 1-hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl 4-diphosphate reductase | 催化 | 内源MEP途径酶，在MpGPS.SSU过表达株系中转录水平上调 |
| 烟草（Nicotiana tabacum） | MEP途径 | MCS | 2C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate synthase | 催化 | 内源MEP途径酶，在MpGPS.SSU过表达株系中转录水平上调 |
| 烟草（Nicotiana tabacum） | 萜类合成 | GGPPS3, GGPPS4 | geranylgeranyl diphosphate synthase | 催化 | 内源GGPP合酶，在MpGPS.SSU过表达株系中转录水平上调 |
| 烟草（Nicotiana tabacum） | 赤霉素生物合成 | GA20ox | GA20-oxidase | 催化 | 内源GA20氧化酶，在MpGPS.SSU过表达株系中转录水平上调，与早花表型相关 |
关键发现
- 在本氏烟草瞬转中，共表达MpGPS.SSU使(-)-柠檬烯产量提高约22-35倍（从0.23±0.05提高到7.52±1.55 μg/g FW/24h）
- (-)-芳樟醇从2.34±0.35提高到5.55±1.55，α-蒎烯从2.79±0.80提高到15.03±3.03，β-蒎烯从0.73±0.24提高到4.05±1.05，月桂烯从3.03±1.04提高到9.56±2.57。转基因烟草中，柠檬烯含量在仅表达PaLimS的L系为3.75±0.37至6.79±0.51，共表达MpGPS.SSU的LG系为24.33±1.17至29.27±5.82 μg/g FW/24h，提高4-8倍
- 芳樟醇提高6-19倍，蒎烯提高2-48倍，月桂烯提高2-14倍。体外实验中，添加0.1、0.3、0.9 μg MBP-MpGPS.SSU使GPP产量分别提高2.2、2.9、4.5倍。MpGPS.SSU过表达导致GA3和细胞分裂素(tZ, iP)含量升高，MEP途径基因DXS、HDR、MCS及GGPPS3、GGPPS4、GA20ox转录水平上调，出现早花和分枝增加表型。
研究结论
共表达薄荷MpGPS.SSU是提高转基因烟草单萜产量的有效策略，该策略还可用于新单萜合酶基因的功能鉴定，具有基础研究及商业化应用潜力。