Transcript profiling of jasmonate-elicited Taxus cells reveals a β-phenylalanine-CoA ligase
- 作者
- Karla Ramírez-Estrada, Teresa Altabella, Miriam Onrubia, Elisabeth Moyano, Cedric Notredame, Lidia Osuna, Robin Vanden Bossche, Alain Goossens, Rosa M. Cusido, Javier Palazon
- 单位
- Secció de Fisiologia Vegetal, Facultat de Farmacia, Universitat de Barcelona, Barcelona, Spain; Center for Research in Agricultural Genomics (CRAG) (CSIC-IRTA-UAB-UB), Cerdanyola, Barcelona, Spain; Departament de Ciències Experimentals i de Salut, Universitat Pompeu Fabra, Barcelona, Spain; Comparative Bioinformatics, Centre for Genomic Regulation (CRG), Barcelona, Spain; Centro de Investigación Biomédica del Sur, Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS), Xochitepec, Mexico; Department of Plant Systems Biology, VIB, Ghent, Belgium; Department of Plant Biotechnology and Bioinformatics, Ghent University, Ghent, Belgium
- 杂志
- Plant Biotechnology Journal（2015）
- DOI
- 10.1111/pbi.12359
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
紫杉醇生物合成途径中仍有多个未知步骤，特别是负责侧链形成的β-苯丙氨酸-CoA连接酶（β-phenylalanine-CoA ligase）的基因尚未鉴定，限制了紫杉醇的可持续生产。
研究策略
采用cDNA-AFLP技术对茉莉酸甲酯（MeJA）诱导的Taxus baccata细胞进行全基因组转录谱分析，结合生物信息学优先排序筛选候选基因，通过RACE克隆全长cDNA，在N. benthamiana中异源表达、纯化酶蛋白，通过体外酶活测定和亚细胞定位分析进行功能鉴定。
核心内容
该研究通过cDNA-AFLP技术对茉莉酸甲酯诱导的欧洲红豆杉细胞进行全基因组转录谱分析，结合生物信息学优先排序和RACE克隆，鉴定并功能验证了一个参与紫杉醇C13侧链合成的关键酶基因TB768（TBPCCL）。在烟草中异源表达并纯化酶蛋白后，体外酶活测定显示该酶能同时催化β-苯丙氨酸和4-香豆酸生成相应CoA酯，其比活性分别为102.309和617.76 μmol/min/mg；HPLC-MS/MS确认了产物β-苯丙氨酰-CoA和4-香豆酰-CoA的生成。亚细胞定位分析表明该酶定位于细胞质。在MeJA诱导的细胞培养中，baccatin III和taxol含量在第20天分别比对照高20.5倍和19倍。该发现填补了紫杉醇生物合成途径中β-苯丙氨酸-CoA连接酶这一空白步骤，为利用代谢工程和合成生物学建立紫杉醇可持续生产系统提供了关键基因资源。
创新点
首次在Taxus spp.中鉴定并功能验证了编码β-苯丙氨酸-CoA连接酶的基因TB768（TBPCCL）；通过cDNA-AFLP结合结构预测筛选出参与紫杉醇生物合成未知步骤的15个候选基因；证明TBPCCL为细胞质定位，且能同时催化β-苯丙氨酸和4-香豆酸生成相应CoA酯。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Taxus baccata | 紫杉醇生物合成 | TB768 (GenBank: KM593667) | TBPCCL (β-phenylalanine- and 4-coumarate-CoA ligase) | 催化 | 茉莉酸甲酯诱导表达，编码的酶催化β-苯丙氨酸和4-香豆酸形成相应CoA酯，参与紫杉醇侧链合成。 |
| Nicotiana benthamiana（瞬时表达宿主） | 紫杉醇生物合成（用于功能验证） | TB768 | TBPCCL-YFP | 催化 | 用于亚细胞定位（细胞质）和体外酶活测定，融合YFP标签。 |
关键发现
- MeJA诱导的T. baccata细胞培养中，baccatin III和taxol含量在第20天分别比对照高20.5倍和19倍；TB768编码的酶对β-苯丙氨酸的比活性为102.309 μmol/min/mg，对4-香豆酸为617.76 μmol/min/mg；HPLC-MS/MS确认产物β-苯丙氨酰-CoA（m/z
- 2，RT
- 93 min）和4-香豆酰-CoA（m/z
- 3，RT
- 95 min）的生成；TBPCCL与Populus tomentosa 4CL1的序列一致性为40%，与已知植物4CL家族相似性在40%-65%之间。
研究结论
TB768基因编码一个细胞质定位的酰基-CoA连接酶（TBPCCL），能将β-苯丙氨酸活化为β-苯丙氨酰-CoA，参与紫杉醇C13侧链的合成。该发现填补了紫杉醇生物合成途径中的空白，为利用代谢工程和合成生物学建立紫杉醇可持续生产系统提供了关键基因资源。