Diterpene synthases of the biosynthetic system of medicinally active diterpenoids in Marrubium vulgare
- 作者
- Philipp Zerbe, Angela Chiang, Harpreet Dullat, Mark O'Neil-Johnson, Courtney Starks, Björn Hamberger, Jörg Bohlmann
- 单位
- Michael Smith Laboratories, University of British Columbia; Sequoia Sciences; Department of Plant and Environmental Sciences, University of Copenhagen
- 杂志
- The Plant Journal（2014）
- DOI
- 10.1111/tpj.12589
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析药用植物夏至草（Marrubium vulgare）中具有药用活性的二萜类化合物（如marrubiin）生物合成系统所涉及的二萜合酶（diTPSs）及其催化功能。
研究策略
结合代谢物谱分析和叶片转录组测序鉴定候选二萜合酶基因，通过体外重组蛋白酶活测定、体内瞬时共表达（大肠杆菌和烟草）、系统发育分析及NMR结构鉴定等手段对二萜合酶进行功能表征。
核心内容
本研究以药用植物夏至草为对象，系统解析了其药用活性二萜（如marrubiin）生物合成途径中的关键二萜合酶。通过代谢物谱与叶片转录组分析鉴定候选基因，结合体外重组酶活测定、大肠杆菌和烟草体内共表达、系统发育分析及NMR结构鉴定进行功能表征，共获得4个功能性二萜合酶。其中，新鉴定的II类合酶MvCPS1以GGPP为底物生成C-9位氧化的peregrinol二磷酸（PPP），其去磷酸化产物peregrinol占产物谱90%以上；多功能I类合酶MvELS具有非典型βα-结构域，可接受PPP、(+)-CPP和LPP三种底物，分别生成9,13-epoxy-labd-14-ene、miltiradiene和manyol oxide。MvCPS1与MvELS偶联时，9,13-epoxy-labd-14-ene为主要产物（相对丰度80%），且双酶在两种异源宿主中成功共表达。此外，MvCPS3鉴定为(+)-CPP合酶，MvEKS为ent-kaurene合酶，而MvCPS2因保守天冬氨酸突变丧失活性。转录分析显示MvCPS1、MvCPS3和MvELS在叶片中表达量分别比花高49倍、28倍和4倍。该工作揭示了MvCPS1与MvELS协同催化marrubiin前体形成的机制，MvELS作为枢纽酶展现的底物混杂性为利用合成生物学手段异源生产marrubiin及相关药用二萜提供了关键酶学基础。
创新点
发现并鉴定了一种新的II类二萜合酶MvCPS1，其催化产生C-9位氧化的peregrinol二磷酸（PPP），不同于已知的在C-8位羟基化的LPP合酶；发现MvELS属于非典型βα-结构域的I类多功能二萜合酶，可接受PPP、(+)-CPP和LPP三种底物，生成9,13-epoxy-labd-14-ene、miltiradiene和manyol oxide等不同骨架产物；揭示了marrubiin生物合成中MvCPS1和MvELS的协同催化机制。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli / Nicotiana benthamiana | 夏至草二萜生物合成（marrubiin途径） | MvCPS1 | peregrinol二磷酸合酶（II类二萜合酶） | 催化 | 催化GGPP环化并C-9氧化生成peregrinol二磷酸（PPP），为MvELS提供底物 |
| Escherichia coli / Nicotiana benthamiana | 夏至草二萜生物合成（marrubiin途径） | MvELS | 多功能I类二萜合酶（βα-结构域） | 催化 | 催化PPP生成9,13-epoxy-labd-14-ene，也可转化(+)-CPP生成miltiradiene、转化LPP生成manyol oxide |
| Escherichia coli / Nicotiana benthamiana | 夏至草萜类特殊代谢（labdane型二萜） | MvCPS3 | (+)-copalyl二磷酸合酶（II类二萜合酶） | 催化 | 催化GGPP生成(+)-CPP，与MvELS偶联生成miltiradiene |
| Escherichia coli / Nicotiana benthamiana | 赤霉素（GA）生物合成（一般代谢） | MvEKS | ent-kaurene合酶（I类二萜合酶） | 催化 | 以ent-CPP为底物生成ent-kaurene，参与赤霉素合成 |
| Escherichia coli / Nicotiana benthamiana | 推测参与赤霉素生物合成 | MvCPS2 | 推测的ent-CPP合酶（II类二萜合酶，无活性） | 催化 | 因DxDD基序中Asp被Val替换（Val506）导致体外及体内均无催化活性 |
| Escherichia coli | 二萜生物合成（异源重构） | MvELS-GGGS-MvCPS1融合蛋白 | MvELS与MvCPS1的融合蛋白 | 催化 | 通过GGGS连接子融合，在大肠杆菌中成功产生9,13-epoxy-labd-14-ene，用于NMR结构鉴定 |
关键发现
- MvCPS1以GGPP为底物生成peregrinol二磷酸（PPP），在温和GC条件下peregrinol（去磷酸化产物）占产物谱90%以上
- MvCPS1与MvELS偶联生成9,13-epoxy-labd-14-ene（经NMR确证），该产物为主要产物（相对丰度80%）
- MvCPS3鉴定为(+)-copalyl二磷酸合酶，MvEKS为ent-kaurene合酶（赤霉素代谢）
- MvCPS2因保守天冬氨酸（Asp503）突变为缬氨酸（Val506）而丧失活性
- qRT-PCR显示MvCPS1、MvCPS3、MvELS在叶片中转录水平分别比花高49倍、28倍、4倍
- MvELS可分别与MvCPS3、CfTPS2（LPS）偶联生成miltiradiene和manyol oxide，表明其底物混杂性
- MvCPS1与MvELS在大肠杆菌和烟草中共表达成功形成9,13-epoxy-labd-14-ene。
研究结论
在Marrubium vulgare中鉴定并功能表征了4个二萜合酶：MvCPS1（peregrinol二磷酸合酶）、MvCPS3（(+)-CPP合酶）、MvEKS（ent-kaurene合酶）和多功能I类二萜合酶MvELS。MvCPS1和MvELS构成marrubiin及C-9氧化的labdane型二萜生物合成途径的关键酶对，MvELS作为模块化系统中的枢纽酶可接受多种II类酶产物，为利用合成生物学手段生产marrubiin及相关药用二萜提供了酶学基础。