A lycopene β-cyclase/lycopene ε-cyclase/light-harvesting complex fusion protein from the green alga Ostreococcus lucimarinus can be modified to produce α-carotene and β-carotene at different ratios
- 作者
- Andreas Blatt, Matthias E. Bauch, Yvonne Pörschke, Martin Lohr
- 单位
- Institut für Allgemeine Botanik, Johannes Gutenberg-Universität, 55099 Mainz, Germany
- 杂志
- The Plant Journal（2015）
- DOI
- 10.1111/tpj.12826
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
研究Mamiellales藻类中罕见的番茄红素环化酶融合蛋白（LCYB-LCYE-LHC）如何催化α-胡萝卜素和β-胡萝卜素的平行合成，并确定影响产物比例的结构因素，以利于生物技术生产不对称类胡萝卜素。
研究策略
从Ostreococcus lucimarinus克隆融合蛋白基因，在番茄红素积累的大肠杆菌中异源表达，通过C端截短、linker缺失、结构域模块组装和嵌合体构建等手段系统分析各结构域对催化活性和产物比例的影响，并构建组成型表达质粒实现α-胡萝卜素的高比例合成。
核心内容
该研究从绿藻Ostreococcus lucimarinus中克隆了罕见的番茄红素环化酶融合蛋白LCYB-LCYE-LHC，并在积累番茄红素的大肠杆菌TOP10中异源表达，通过C端截短、linker缺失、结构域模块组装和嵌合体构建等手段系统解析了各结构域对催化活性和α-/β-胡萝卜素产物比例的影响。全长融合蛋白在E. coli中平行合成α-和β-胡萝卜素，摩尔比约1.4；截短C端248或272个氨基酸时α-胡萝卜素比例最高，继续截短则比例反转。删除linker S1中保守的IPXPX基序使α/β比例从约3降至<1.5，而删除linker S1 C-近端一半则使比例升至6，表明linker区和LHC结构域对两个环化酶结构域相对活性具有关键调节作用。利用截短突变体构建的组成型表达质粒pALPHA1（Δ312）使E. coli积累α-与β-胡萝卜素比例约3:1，pALPHA2（Δ248）几乎专一积累α-胡萝卜素。该工作揭示了Mamiellales环化酶融合蛋白通过结构域间构象调节平衡碳流的机制，为微生物中高效生产不对称类胡萝卜素提供了可用的工程工具。
创新点
首次详细功能表征Mamiellales的LCYB-LCYE-LHC融合蛋白；揭示LHC结构域和linker区域对两个环化酶结构域相对活性的调节作用；开发出能在E. coli中组成型合成高比例α-胡萝卜素的质粒pALPHA1和pALPHA2。
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli TOP10 | 类胡萝卜素生物合成 | OluLCY | LCYB-LCYE-LHC融合蛋白 | 催化 | 来自Ostreococcus lucimarinus的天然融合蛋白，同时具有β和ε环化酶活性，催化番茄红素生成α-和β-胡萝卜素 |
| Escherichia coli TOP10 | 类胡萝卜素生物合成 | OluLCYB | 番茄红素β-环化酶结构域 | 催化 | 融合蛋白N端结构域，单独表达时生成β-胡萝卜素 |
| Escherichia coli TOP10 | 类胡萝卜素生物合成 | OluLCYE | 番茄红素ε-环化酶结构域 | 催化 | 融合蛋白中间结构域，单独表达时生成δ-胡萝卜素 |
| Escherichia coli TOP10 | 类胡萝卜素生物合成 | CrLCYB | 莱茵衣藻番茄红素β-环化酶 | 催化 | 用于替换融合蛋白LCYB结构域构建嵌合体 |
| Escherichia coli TOP10 | 类胡萝卜素生物合成 | CrLCYE | 莱茵衣藻番茄红素ε-环化酶 | 催化 | 用于替换融合蛋白LCYE结构域构建嵌合体 |
| Escherichia coli TOP10 | 类胡萝卜素生物合成 | OluLCYΔ312 | 截短融合蛋白（缺C端312 aa） | 催化 | 用于质粒pALPHA1，组成型表达产生α/β约3:1 |
| Escherichia coli TOP10 | 类胡萝卜素生物合成 | OluLCYΔ248 | 截短融合蛋白（缺C端248 aa） | 催化 | 用于质粒pALPHA2，几乎专一产生α-胡萝卜素 |
| Escherichia coli TOP10 | 类胡萝卜素生物合成 | OluLCY | LHC结构域（C端） | 调控 | 影响两个环化酶结构域的活性比例，截除后α-胡萝卜素比例增加 |
| Escherichia coli TOP10 | 类胡萝卜素生物合成 | OluLCY | Linker S1（连接LCYB和LCYE的区域） | 调控 | 序列长度和保守基序（IPXPX）影响产物比例，删除该基序使α/β比例从3降至<1.5 |
关键发现
- 全长OluLCY（Δ49 aa）在E. coli中平行合成α-胡萝卜素和β-胡萝卜素，摩尔比约1.4
- C端截短196 aa使产物比例向α-胡萝卜素移动，截短248或272 aa时α-胡萝卜素比例最高，进一步截短则比例反转
- 删除linker S1中保守IPXPX基序（5 aa）使α/β比例从约3降至<1.5，删除linker S1 C-近端一半（aa593-630）使比例从3升至6
- 嵌合蛋白ce-S-B（CrLCYE-linker-OluLCYB）产生约40% α-胡萝卜素、40% δ-胡萝卜素和20% β-胡萝卜素，但仅约50%番茄红素被转化
- 质粒pALPHA1（含OluLCYΔ312）使E. coli积累α-与β-胡萝卜素的比例约3:1，pALPHA2（含OluLCYΔ248）几乎专一积累α-胡萝卜素。
研究结论
Mamiellales的番茄红素环化酶融合蛋白通过结构域间相对活性和构象调节来平衡α-/β-分支的碳流；该融合蛋白经结构改造可作为微生物中生产α-胡萝卜素和叶黄素等不对称类胡萝卜素的有效工具。