Transient expression in Nicotiana benthamiana for rapid functional analysis of genes involved in non-photochemical quenching and carotenoid biosynthesis
- 作者
- Lauriebeth Leonelli, Erika Erickson, Dagmar Lyska, Krishna K. Niyogi
- 单位
- Howard Hughes Medical Institute, Department of Plant and Microbial Biology, University of California, Berkeley, CA 94720-3102; Molecular Biophysics and Integrated Bioimaging Division, Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, CA 94720
- 杂志
- The Plant Journal（2017）
- DOI
- 10.1111/tpj.13268
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
传统稳定转基因方法耗时费力，难以快速表征来自遗传难处理生物（如海洋藻类）的NPQ和类胡萝卜素生物合成相关基因的功能。
研究策略
利用农杆菌介导的瞬时表达系统，在完全展开的烟草叶片中快速表达候选基因，通过叶绿素荧光成像测量NPQ动力学、HPLC分析色素组成，以及免疫印迹检测蛋白积累，从而在统一背景下快速评估基因功能。
核心内容
本研究建立了一套基于农杆菌介导的烟草瞬时表达系统，用于快速表征来自远缘光合生物的NPQ和类胡萝卜素合成基因功能。在展开的烟草叶片中瞬时表达候选基因，结合叶绿素荧光成像、HPLC色素分析和免疫印迹，在统一背景下完成了功能评估。过表达AtVDE使强光处理前脱环氧化状态（DES）达0.380，处理15分钟后升至0.573，而GUS对照分别为0和0.319；AtZEP过表达则使DES仅为0.113且无玉米黄质积累。不同来源PSBS同源基因中，PpPSBS赋予最高qE且蛋白积累量较低，CrPSBS虽在原生生物中无功能证据，却在烟草中表现出质子化依赖性淬灭活性，但导致Fv/Fm降至0.76。四个海洋藻类类胡萝卜素基因中，NoVDE和TpDDE分别使强光10分钟DES达0.579和0.566，高于对照的0.501；NoCYP97F5使β-胡萝卜素降低25%且β-黄素池增加2倍；NoZEP1使lutein减少超一半并产生非天然色素lutein epoxide。该瞬时表达系统为快速评估远缘物种光合调控基因功能提供了简便且强大的工具，并展现出操纵类胡萝卜素组成以优化光合作用的潜力。
创新点
1. 首次证明瞬时表达可在成熟叶片中有效调节动态光合过程（NPQ）；2. 利用天然变异比较了来自绿藻、苔藓和被子植物的PSBS同源基因的功能差异；3. 功能鉴定了四个海洋藻类类胡萝卜素生物合成基因，并发现NoZEP1具有松弛底物特异性，可产生非天然色素lutein epoxide。
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Nicotiana benthamiana | 非光化学淬灭（qE） | AtPSBS | PSBS（PsbS） | 调控 | 拟南芥PSBS蛋白，作为pH传感器参与反馈脱激发（qE）的调控，过表达显著增强NPQ。 |
| Nicotiana benthamiana | 紫黄素循环（VAZ） | AtVDE | 紫黄素脱环氧化酶 | 催化 | 催化紫黄素转化为玉米黄质，过表达加快NPQ诱导并导致暗中积累玉米黄质。 |
| Nicotiana benthamiana | 紫黄素循环（VAZ） | AtZEP | 玉米黄质环氧化酶 | 催化 | 催化玉米黄质转化为紫黄素，过表达减慢NPQ诱导且强光下不积累玉米黄质。 |
| Nicotiana benthamiana | 非光化学淬灭（qE） | CrPSBS | PSBS（PsbS） | 调控 | 莱茵衣藻PSBS，与AtPSBS转运肽融合后表达，具有质子化依赖性淬灭活性，但降低Fv/Fm并延迟ΦPSII恢复。 |
| Nicotiana benthamiana | 非光化学淬灭（qE） | PpPSBS | PSBS（PsbS） | 调控 | 小立碗藓PSBS，赋予测试中最高qE水平，且蛋白积累量低于AtPSBS。 |
| Nicotiana benthamiana | 紫黄素循环（VAZ） | NoVDE | 紫黄素脱环氧化酶 | 催化 | 来自微拟球藻，与AtVDE同源，表达后强光下加速NPQ诱导，DES达0.579。 |
| Nicotiana benthamiana | 紫黄素循环（VAZ） | TpDDE | 脱环氧化酶（DDE） | 催化 | 来自假微型海链藻，与AtVDE同源，表达后强光下DES达0.566，加速NPQ诱导。 |
| Nicotiana benthamiana | 紫黄素循环/类胡萝卜素生物合成 | NoZEP1 | 玉米黄质环氧化酶 | 催化 | 来自微拟球藻，具有环氧化酶活性，但底物特异性松弛，可同时环化lutein产生lutein epoxide。 |
| Nicotiana benthamiana | 类胡萝卜素生物合成 | NoZEP2 | 玉米黄质环氧化酶同源物 | 催化 | 来自微拟球藻，预测为环氧化酶，但在烟草中未检测到环氧化酶活性。 |
| Nicotiana benthamiana | 类胡萝卜素生物合成（β-胡萝卜素羟化） | NoCYP97F5 | 细胞色素P450 β-胡萝卜素羟化酶 | 催化 | 来自微拟球藻，表达后增加β-黄素池（2倍），降低β-胡萝卜素25%，但未增强NPQ。 |
关键发现
- 过表达AtVDE使叶片在强光处理前（时间0）的脱环氧化状态（DES）达0.380，强光15分钟后达0.573，而GUS对照分别为0和0.319；AtZEP过表达在强光15分钟后DES仅为0.113，且玉米黄质不积累。
- AtPSBS过表达显著增强NPQ；PpPSBS赋予最高qE，且蛋白积累量较低；CrPSBS虽在原生生物中无功能证据，但在烟草中表现出质子化依赖性淬灭活性，但导致Fv/Fm降至0.76±0.04（对照为0.81±0.01）。
- NoVDE和TpDDE表达后，强光10分钟处理的DES分别为0.579±0.015和0.566±0.013，高于GUS对照的0.501±0.017。
- NoCYP97F5表达使β-胡萝卜素降低25%，β-黄素池增加2倍，但强光10分钟后DES（0.353±0.019）低于GUS对照（0.501±0.017），且未增强NPQ。
- NoZEP1表达使lutein积累减少超过一半，产生lutein epoxide（Lx），强光10分钟后Lx减少20%并伴随lutein的化学计量增加。
研究结论
农杆菌介导的N. benthamiana瞬时表达是一种快速、简便且强大的工具，可用于评估来自远缘光合生物的NPQ和类胡萝卜素合成基因功能，并具有操纵类胡萝卜素组成以优化光合作用的潜力。