Identification of a drimenol synthase and drimenol oxidase from Persicaria hydropiper, involved in the biosynthesis of insect deterrent dimanes
- 作者
- Maurice Henquet, Neli Prota, Justin J.J van der Hooft, Marina Varbanova-Herde, Raymond J.M. Hulzink, Martin de Vos, Marcel Prins, Michiel T.J. de Both, Maurice C.R. Franssen, Harro Bouwmeester, Maarten Jongsma
- 单位
- PRI- Bioscience, Wageningen University and Research Centre, Wageningen, The Netherlands; Laboratory of Plant Physiology, Wageningen University and Research Centre, Wageningen, The Netherlands; Laboratory of Biochemistry, Wageningen University and Research Centre, Wageningen, The Netherlands; Keygene N.V., Wageningen, The Netherlands; Laboratory of Organic Chemistry, Wageningen University and Research Centre, Wageningen, The Netherlands; Plant Hormone Biology lab, Swammerdam Institute for Life Sciences, University of Amsterdam, Science Park 904, 1098 XH Amsterdam, the Netherlands
- 杂志
- The Plant Journal（2017）
- DOI
- 10.1111/tpj.13527
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析水蓼（Persicaria hydropiper）中昆虫拒食性drimane类倍半萜（如polygodial）的生物合成途径，特别是鉴定催化drimenol生成及其氧化修饰的关键酶基因。
研究策略
构建P. hydropiper与P. maculosa的454 EST文库，通过比较转录丰度筛选候选基因；在酿酒酵母和本氏烟草中异源表达，结合GC-MS、LC-MS和NMR进行产物鉴定；进一步通过体外酶活分析和昆虫拒食行为实验评价产物功能。
核心内容
本研究从水蓼中解析了昆虫拒食性drimane类倍半萜的生物合成途径，鉴定了两个关键酶基因PhDS和PhDOX1。通过构建水蓼与斑点蓼的EST文库并比较转录丰度筛选候选基因，在酿酒酵母和本氏烟草中异源表达，结合GC-MS、LC-MS和NMR鉴定产物。PhDS编码559氨基酸的drimenol合成酶，与缬草中已知酶仅30%序列同一性；PhDOX1属于CYP76AJ1亚家族，体外催化drimenol羟化的Km为11 μM。在烟草中单独表达PhDS产生约392 μg/gFW drimenol，而靶向质体或线粒体使产量分别降低40倍和400倍；共表达两基因后主要产物为cinnamolide，几乎完全转化drimenol。水蓼花中polygodial含量高达6.2 mg/gFW。昆虫拒食实验显示cinnamolide对白粉虱和蚜虫的ED50分别为195和423 μg/gFW，而polygodial分别为25和54 μg/gFW。研究表明PhDOX1仅催化C-12位羟基化生成drimendiol，后续醛化和内酯环形成由宿主内源酶完成，polygodial的完整合成可能需要额外P450酶及特定储存结构以避免其反应性。
创新点
首次从水蓼中克隆并鉴定了drimenol合成酶（PhDS）和细胞色素P450氧化酶（PhDOX1，命名为CYP76AJ1）；揭示了PhDOX1仅催化drimenol C-12位羟基化生成drimendiol，后续醛化和内酯环形成由宿主内源酶完成；发现cinnamolide对银叶粉虱和桃蚜具有剂量依赖的拒食活性。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae | drimane倍半萜生物合成 | PhDS | Drimenol synthase | 催化 | 在水蓼中高表达，酵母中表达催化FPP环化生成drimenol |
| Saccharomyces cerevisiae | drimane倍半萜生物合成 | PhDOX1 | Drimenol oxidase (CYP76AJ1) | 催化 | 催化drimenol C-12羟基化生成drimendiol，Km=11 μM；与PhDS共表达产生cinnamolide |
| Nicotiana benthamiana | drimane倍半萜生物合成 | PhDS | Drimenol synthase | 催化 | 单独表达产生约392 μg/gFW drimenol；靶向质体或线粒体产量降低 |
| Nicotiana benthamiana | drimane倍半萜生物合成 | PhDOX1 | Drimenol oxidase (CYP76AJ1) | 催化 | 与PhDS共表达时几乎完全转化drimenol，主要产物为cinnamolide |
| Nicotiana benthamiana | 萜类前体合成 | AtFPS2 | Farnesyl diphosphate synthase | 催化 | 来自拟南芥，用于增加FPP供给 |
| Nicotiana benthamiana | 甲羟戊酸途径 | AtHMGR | 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase | 催化 | 来自拟南芥，截短型，用于增加IPP/DMAPP供给 |
| Saccharomyces cerevisiae | P450电子传递 | ATR1 | NADPH-cytochrome P450 reductase | 能量供给 | 来自拟南芥，为P450提供电子 |
关键发现
- P. hydropiper花中polygodial含量高达6.2 mg/gFW
- PhDS cDNA全长1677 bp，编码559氨基酸蛋白，与V. officinalis的drimenol合酶仅30%序列同一性，且含两个DDxxD基序
- PhDOX1编码503氨基酸蛋白，属于CYP76AJ1亚家族，体外催化drimenol羟化的Km为11 μM
- 在烟草中单独表达PhDS产生约392 μg/gFW drimenol，而靶向质体或线粒体使产量分别降低40倍和400倍
- PhDS与PhDOX1共表达于烟草产生七个可检测化合物，主要产物cinnamolide（MH+ 235.1691），几乎完全转化drimenol
- 在酵母中共表达产生drimenol、drimendiol和cinnamolide
- cinnamolide对白粉虱和蚜虫的ED50分别为195 μg/gFW和423 μg/gFW，而polygodial分别为25 μg/gFW和54 μg/gFW。
研究结论
从水蓼中鉴定了两个参与drimane类倍半萜生物合成的关键基因PhDS和PhDOX1，二者在异源宿主中表达可产生drimenol、drimendiol及cinnamolide。研究提出cinnamolide由drimendiol经内源酶氧化成醛后自发半缩醛化再氧化形成，而polygodial的完整生物合成可能需要额外P450酶及特定的储存结构以避免其反应性。