Isoprenoid Biosynthesis in a Cell-Free System from Pea Shoots
- 作者
- Jan E. Graebe
- 单位
- Pflanzenphysiologisches Institut der Universität 34, Göttingen, Germany
- 杂志
- Science（1967）
- DOI
- 10.1126/science.157.3784.73
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
研究豌豆芽无细胞系统中类异戊二烯的生物合成途径，以及辅因子对其产物分布的调控作用。
研究策略
构建豌豆芽匀浆分级分离得到的可溶性部分(S-200)和质体片段(P-35)组成的无细胞孵育系统，以2-14C标记的甲羟戊酸为底物，通过改变辅因子（吡啶核苷酸、Mn2+）和酶组分比例，结合薄层色谱和放射性检测分析产物分布。
核心内容
该研究构建了由豌豆芽匀浆分级分离得到的可溶性部分（S-200）与质体片段（P-35）组成的无细胞孵育系统，以2-14C标记的甲羟戊酸为底物，通过改变吡啶核苷酸、Mn2+等辅因子及酶组分比例，结合薄层色谱与放射性检测分析类异戊二烯产物的分布。结果显示，基本体系中可合成法尼醇（12,000 cpm）和牻牛儿基牻牛儿醇（25,100 cpm），底物转化率约20%；加入吡啶核苷酸后主要产物转为角鲨烯（24,900 cpm）；加入Mn2+后牻牛儿基牻牛儿醇产量增至27,800 cpm，并出现三个与类胡萝卜素前体相关的未鉴定峰（合计6,800 cpm）；将P-35减少至标准量的1/10时，法尼醇成为主要产物（21,500 cpm）。重结晶证实产物以反式构型为主。该研究首次在植物茎部无细胞系统中实现从甲羟戊酸到牻牛儿基牻牛儿醇的合成，并揭示辅因子可调控类异戊二烯通路的分流，为研究植物类异戊二烯代谢调控提供了可操作的体外系统。
创新点
首次在植物茎部无细胞系统中实现从甲羟戊酸到牻牛儿基牻牛儿醇的合成；发现吡啶核苷酸和Mn2+可调控类异戊二烯通路的分流。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pisum sativum (豌豆芽) | 类异戊二烯生物合成（甲羟戊酸途径） | — | 可溶性酶组分（S-200） | 催化 | 含有从甲羟戊酸到法尼基焦磷酸的酶系 |
| Pisum sativum (豌豆芽) | 类异戊二烯生物合成（甲羟戊酸途径） | — | 质体片段酶组分（P-35） | 催化 | 含有将法尼基焦磷酸转化为牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸及后续产物的酶系 |
关键发现
- 基本孵育体系中从2-14C-甲羟戊酸合成法尼醇(12,000 cpm)和牻牛儿基牻牛儿醇(25,100 cpm)，底物转化率约20%（或40%活性异构体）
- 加入吡啶核苷酸后主要产物为角鲨烯(24,900 cpm)
- 加入Mn2+后牻牛儿基牻牛儿醇产量增至27,800 cpm，并出现三个与类胡萝卜素前体相关的未鉴定峰(合计6,800 cpm)
- 将P-35质体片段减少至标准量的1/10时，法尼醇成为主要产物(21,500 cpm)。通过重结晶确认至少90%放射性在反式牻牛儿基牻牛儿醇中，至少89%在反式法尼醇中，角鲨烯的放射性几乎全部与其关联。
研究结论
豌豆芽无细胞系统能高效利用甲羟戊酸合成多种类异戊二烯，产物分布受辅因子和酶组分比例调节，为研究植物类异戊二烯代谢调控提供了可操作的体外系统。