A Balancing Act for Taxol Precursor Pathways in E. coli
- 作者
- Tiangang Liu, Chaitan Khosla
- 杂志
- Science（2010）
- DOI
- 10.1126/science.1195014
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
如何在大肠杆菌中高效合成紫杉醇前体taxadiene及其羟化产物taxadiene-5α-ol，以解决紫杉醇来源昂贵和提取破坏环境的问题。
研究策略
通过优化大肠杆菌内源非甲羟戊酸（MEP）途径中四个关键酶的表达水平和比例，异源表达紫杉醇途径中的限速酶（GGPP合酶和taxadiene合酶），并系统平衡上游IPP/DMAPP供给段与下游taxadiene合成段之间的碳通量。
核心内容
该研究针对紫杉醇天然来源稀缺且提取破坏环境的问题，在大肠杆菌中系统重构了紫杉醇前体taxadiene及其羟化产物taxadiene-5α-ol的生物合成途径。作者通过优化内源非甲羟戊酸（MEP）途径中四个关键酶的表达水平与比例，异源表达经密码子优化和去除N端质体转运肽的GGPP合酶与taxadiene合酶，并对超过30种多基因组合进行系统评估，精细平衡了上游IPP/DMAPP供给与下游taxadiene合成之间的碳通量。最终在实验室发酵罐中实现taxadiene体积生产率8 mg/L/h、终浓度1 g/L，较此前报道的1.3 mg/L提高近三个数量级；利用嵌合细胞色素P450酶进一步实现taxadiene-5α-ol的合成，终浓度达60 mg/L。此外，研究还发现吲哚浓度与taxadiene生产率呈负相关，可用于指导发酵优化。该工作展示了通过系统性平衡内源与异源代谢通量实现复杂植物源萜类前体高产的可行性，为其他萜类天然产物的微生物制造提供了可借鉴的策略。
创新点
首次在大肠杆菌中实现taxadiene克级产量；利用密码子优化和去除N端质体转运肽提高植物酶活性；通过评估超过30种多基因组合实现通量精细平衡；利用嵌合细胞色素P450酶实现taxadiene-5α-ol的生物合成；发现吲哚浓度与taxadiene生产率呈负相关并用于指导优化。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 非甲羟戊酸途径 (MEP/DXP途径) | — | 四个关键酶（未具体指明，推测包括DXP合成酶、DXP还原异构酶等） | 催化 | 内源IPP和DMAPP合成途径 |
| Escherichia coli | 紫杉醇生物合成途径 | — | GGPP合酶 (geranylgeranyl pyrophosphate synthase) | 催化 | 来自太平洋紫杉，密码子优化并去除N端质体转运肽 |
| Escherichia coli | 紫杉醇生物合成途径 | — | taxadiene合酶 (taxadiene synthase) | 催化 | 来自太平洋紫杉，将GGPP环化为taxadiene |
| Escherichia coli | 紫杉醇生物合成途径 | — | 细胞色素P450氧化酶 (cytochrome P450 hydroxylase) | 催化 | 来自太平洋紫杉，催化taxadiene生成taxadiene-5α-ol |
| Escherichia coli | 紫杉醇生物合成途径 | — | 细胞色素P450还原酶 (cytochrome P450 reductase) | 催化 | 与P450形成嵌合酶，用于大肠杆菌中的电子传递 |
关键发现
- 优化后大肠杆菌合成taxadiene的体积生产率为8 mg/L/h，在实验室发酵罐中最终浓度达1 g/L
- 此前报道的产量仅为1.3 mg/L。taxadiene-5α-ol的最终浓度为60 mg/L，实现了对惰性碳氢化合物的羟化。作者评估了超过30种多基因构建体，并通过协调四个MEP途径酶的表达、密码子优化及去除植物酶转运肽达到上述结果。
研究结论
通过系统平衡大肠杆菌内源MEP途径与异源紫杉醇前体合成途径，可以实现紫杉醇关键前体taxadiene和taxadiene-5α-ol的高产，为其他植物源萜类天然产物的微生物生产提供了范例。