Alternative biotransformation of retinal to retinoic acid or retinol with cofactor switch by aldehyde dehydrogenase from Bacillus cereus
- 作者
- Seung-Hye Hong, Ho-Phuong-Thuy Ngo, Hyun-Koo Nam, Kyoung-Rok Kim, Lin-Woo Kang, Deok-Kun Oh
- 单位
- Department of Bioscience and Biotechnology, Konkuk University; Department of Biological Sciences, Konkuk University
- 杂志
- Applied and Environmental Microbiology（2017）
- DOI
- 10.1128/AEM.00848-16
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
目前视黄酸仅通过化学合成生产，缺乏有效的生物催化路线，且尚未发现可将视黄醛转化为视黄酸的细菌乙醛脱氢酶。
研究策略
以人ALDH1A1序列为探针筛选细菌同源酶，获得蜡样芽胞杆菌ALDH（BcALDH），通过克隆表达、酶学表征、定点突变及辅因子切换，实现视黄醛向视黄酸或视黄醇的替代性生物转化。
核心内容
本研究以人ALDH1A1序列为探针，从蜡样芽胞杆菌中筛选并克隆了首个具有视黄醛氧化活性的细菌乙醛脱氢酶BcALDH。该酶以NAD⁺为辅因子将视黄醛氧化为视黄酸，Km为7 μM，kcat/Km为40 mM⁻¹min⁻¹；当切换为辅因子NADPH时，BcALDH可将视黄醛还原为视黄醇，实现同一酶催化的双向转化。通过定点突变获得E194S和E457V变体，其还原催化效率分别为野生型的15倍和6.2倍，其中E457V氧化催化效率亦提高至野生型的7.5倍。在400 μM底物下，野生型、E194S、E457V以5 mM NAD⁺反应240 min均生成210 μM视黄酸（摩尔转化率53%）；以NADPH为辅因子时三者分别生成20、90、40 μM视黄醇，转化率分别为5%、24%、11%。人ALDH1A1的E196S变体也使视黄醇产量由3 μM提升至13 μM。E266A和C300A变体则完全丧失氧化活性，提示关键残基功能。该研究首次证明细菌ALDH可替代化学合成生产视黄酸，并通过辅因子切换和突变优化实现视黄醇的生物合成，为类视黄醇的微生物制造提供了新酶工具。
创新点
首次鉴定出具有视黄醛氧化为视黄酸活性的细菌ALDH（BcALDH）；首次发现BcALDH和人ALDH1A1可通过辅因子切换（NADPH）将视黄醛还原为视黄醇；通过定点突变（E194S、E457V）显著提高还原活性。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli ER2566 | 视黄酸/视黄醇代谢（类视黄醇合成） | bcer0002_25940 | BcALDH（乙醛脱氢酶） | 催化 | 来源于蜡样芽胞杆菌，可催化视黄醛氧化为视黄酸（NAD(P)⁺）或还原为视黄醇（NADPH）；关键催化残基Glu266、Cys300，辅因子结合残基Glu194、Glu457 |
| Escherichia coli ER2566 | 视黄酸/视黄醇代谢（类视黄醇合成） | aldhal1 | 人ALDH1A1 | 催化 | 人视网膜脱氢酶ALDH1A1，与BcALDH具有类似的双向催化活性；E196S变体提高视黄醇产量 |
| Escherichia coli ER2566 | 视黄酸/视黄醇代谢（类视黄醇合成） | bcer0002_25940（E194S突变体） | BcALDH E194S | 催化 | 辅因子结合位点突变，NADPH还原视黄醛的催化效率提高15倍，NADPH下生成视黄醇90 μM |
| Escherichia coli ER2566 | 视黄酸/视黄醇代谢（类视黄醇合成） | bcer0002_25940（E457V突变体） | BcALDH E457V | 催化 | 底物结合通道残基突变，氧化催化效率提高7.5倍，还原催化效率提高6.2倍，NADPH下生成视黄醇40 μM |
| Escherichia coli ER2566 | 视黄酸/视黄醇代谢（类视黄醇合成） | aldhal1（E196S突变体） | 人ALDH1A1 E196S | 催化 | 对应BcALDH Glu194，突变后视黄醇产量提高到13 μM，为野生型的4.6倍 |
关键发现
- BcALDH氧化视黄醛的Km为7 μM，kcat/Km为40 mM⁻¹min⁻¹
- E194S和E457V变体的还原催化效率分别为野生型的15倍和6.2倍，E457V氧化催化效率为野生型的7.5倍
- 以5 mM NAD⁺为辅因子，400 μM视黄醛经野生型、E194S、E457V反应240 min均生成210 μM视黄酸（摩尔转化率53%）
- 以5 mM NADPH为辅因子，三者分别生成20、90、40 μM视黄醇（摩尔转化率5%、24%、11%）
- 人ALDH1A1 E196S变体视黄醇产量13 μM，为野生型（3 μM）的4.6倍。E266A和C300A变体完全丧失氧化活性。
研究结论
BcALDH是首个能催化视黄醛生成视黄酸的细菌酶，并可通过辅因子切换实现视黄醛向视黄醇的还原；突变的E194S和E457V变体可进一步提高视黄醇产量，为类视黄醇（视黄酸和视黄醇）的生物技术生产提供了新酶工具。