Identification of Isopentenol Biosynthetic Genes from Bacillus subtilis by a Screening Method Based on Isoprenoid Precursor Toxicity
- 作者
- Sydnor T. Withers, Shayin S. Gottlieb, Bonny Lieu, Jack D. Newman, Jay D. Keasling
- 单位
- Department of Chemical Engineering, University of California, Berkeley; Department of Bioengineering, University of California, Berkeley; Amyris Biotechnologies; Synthetic Biology Department, Physical Bioscience Division, Lawrence Berkeley National Laboratory; California Institute for Quantitative Biomedical Research (QB3), University of California, Berkeley
- 杂志
- Applied and Environmental Microbiology（2007）
- DOI
- 10.1128/AEM.00861-07
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
传统基于序列相似性发现萜烯合酶基因的方法局限于植物来源，缺乏适用于微生物的通用筛选方法，难以发现非植物、序列不保守的萜烯合酶基因。
研究策略
利用异戊二烯前体（prenyl diphosphate）积累对宿主细胞的毒性，构建能够消耗这些前体的萜烯合酶基因表达文库，通过恢复生长的表型筛选富集目标克隆。
核心内容
本研究开发了一种不依赖序列相似性的表型筛选方法，用于鉴定微生物中参与异戊烯醇生物合成的基因。该方法利用异戊二烯前体（IPP/DMAPP）积累对宿主细胞的毒性作为选择压力，将枯草芽孢杆菌基因组文库导入大肠杆菌中，通过恢复生长的表型富集能够消耗这些前体的目标克隆。混合培养实验表明，表达ADS的细胞在10 mM甲羟戊酸条件下8.5小时内从50%富集至约96%，证明该策略可行。利用此方法从枯草芽孢杆菌中分离出yhfR和nudF两个基因，二者表达均能解除前体毒性。体外实验显示YhfR可将DMAPP转化为2-甲基-3-丁烯-1-醇，而NudF在大肠杆菌中表达后，以甲羟戊酸途径提供IPP，培养66小时最高产生1.3 mM异戊烯醇。该筛选方法为序列信息有限的微生物中鉴定萜烯合酶及前体消耗酶提供了通用工具，可望拓展至复杂微生物群落和定向进化研究。
创新点
开发了不依赖序列相似性的表型筛选方法，利用前体毒性作为选择压力，成功从Bacillus subtilis基因组文库中分离出参与异戊烯醇合成的基因yhfR和nudF。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli DH10B | 甲羟戊酸途径（异戊二烯前体合成） | ADS (amorpha-4,11-diene synthase) | Amorpha-4,11-diene synthase | 催化 | 作为对照验证筛选方法，作用于FPP生成amorphadiene，缓解FPP毒性 |
| Escherichia coli DH10B | 甲羟戊酸途径（异戊二烯前体合成） | pMBI（包含mvaK、mvaD、mvd、idi、ispA） | 甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶、IPP异构酶、FPP合酶 | 催化 | 用于从甲羟戊酸合成FPP或IPP/DMAPP，产生前体毒性 |
| Escherichia coli DH10B | 异戊二烯前体代谢 | yhfR | YhfR（注释为2,3-磷酸甘油酸变位酶，实际为磷酸酶） | 催化 | 将DMAPP/IPP转化为异戊烯醇，解除毒性；对FPP无活性 |
| Escherichia coli DH1 | 甲羟戊酸途径与异戊烯醇合成 | nudF | NudF（ADP-核糖焦磷酸酶亚家族Nudix水解酶） | 催化 | 作用于IPP/DMAPP生成异戊烯醇；在含完整甲羟戊酸途径的DH1中最高产生1.3 mM异戊烯醇 |
| Bacillus subtilis 6051 | 异戊二烯生物合成（DXP途径） | yhfR 和 nudF | YhfR 和 NudF | 催化 | B. subtilis 6051基因组文库来源基因，不参与已知萜烯代谢 |
| Escherichia coli W3110 | 乳糖操纵子（筛选标记） | lacI | LacI 阻遏蛋白 | 调控 | 用于检测质粒上的lacI突变；突变导致组成型表达，作为富集过程中的干扰因素 |
关键发现
- 混合培养实验中，表达ADS的细胞在10 mM甲羟戊酸条件下8.5小时内从50%富集至约96%（约4.5倍富集），而对照菌落数由600±40降至21±2
- 从B. subtilis 6051文库中筛选到yhfR和nudF，二者表达均能解除IPP/DMAPP毒性
- YhfR体外可将DMAPP转化为2-甲基-3-丁烯-1-醇（异戊烯醇），NudF在大肠杆菌中表达后，以甲羟戊酸途径提供IPP，最高产生1.3 mM异戊烯醇（培养66小时）。
研究结论
该筛选方法可有效鉴定萜烯合酶及消耗异戊二烯前体的酶基因，尤其适用于序列信息有限的微生物，有望拓展至复杂微生物群落和定向进化研究。