Deletion of Genes Encoding Cytochrome Oxidases and Quinol Monooxygenase Blocks the Aerobic-Anaerobic Shift in Escherichia coli K-12 MG1655
- 作者
- Vasiliy A. Portnoy, David A. Scott, Nathan E. Lewis, Yekaterina Tarasova, Andrei L. Osterman, Bernhard Ø. Palsson
- 单位
- Department of Bioengineering, University of California, San Diego; Sanford Burnham Medical Research Institute
- 杂志
- Applied and Environmental Microbiology（2010）
- DOI
- 10.1128/AEM.01178-10
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
去除大肠杆菌末端细胞色素氧化酶和奎醇单加氧酶后，菌株无法进行有氧-无氧代谢转换，其代谢和调控机制不清。
研究策略
通过基因敲除构建ECOM4菌株，结合适应性进化获得ECOM4LA克隆；利用全基因组转录组、13C示踪、生理表征和醌库分析，揭示其有氧条件下呈现厌氧生理的分子机制。
核心内容
该研究通过敲除大肠杆菌MG1655中编码末端细胞色素氧化酶（cydAB、cyoABCD、cbdAB）和奎醇单加氧酶（ygiN）的四个基因，构建了ECOM4菌株，并结合适应性进化获得ECOM4LA克隆。结果显示，敲除后氧摄取率降至野生型的约1/60（0.21对16.49 mmol/g DCW/h），醌库组成从以泛醌为主转变为以甲基萘醌为主（有氧下含量达450 nmol/g DCW），进而组成性激活ArcB/ArcA双组分调控系统。转录组分析证实ArcA regulon显著富集，TCA循环通量几乎为零，PPP通量较野生型大幅降低。ECOM4LA在有氧和无氧条件下均以D-乳酸为唯一副产物（有氧产率98%），且两种条件下的生长速率相近。该工作揭示了末端氧化酶缺失通过醌库重塑激活ArcA、使菌株在有氧下呈现厌氧发酵生理的机制，为利用大肠杆菌平台菌株生产还原性产物提供了新的改造策略。
创新点
首次报道在大肠杆菌有氧生长中组成性激活ArcA调控系统；通过敲除四个基因使醌库从泛醌转变为甲基萘醌，导致ArcA活化，菌株在有氧无氧下表现相似的发酵生理；建立了可用于厌氧菌株设计适配的平台菌株。
研究对象（15）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli K-12 MG1655 | 呼吸链 | cydAB | 细胞色素bd氧化酶 | 催化 | 末端氧化酶，敲除后减少氧利用 |
| Escherichia coli K-12 MG1655 | 呼吸链 | cyoABCD | 细胞色素bo3氧化酶 | 催化 | 末端氧化酶，敲除后减少氧利用 |
| Escherichia coli K-12 MG1655 | 呼吸链 | cbdAB | 细胞色素bd-II氧化酶 | 催化 | 末端氧化酶，敲除后减少氧利用 |
| Escherichia coli K-12 MG1655 | 醌代谢 | ygiN | 奎醇单加氧酶 | 催化 | 敲除后改变醌库组成 |
| Escherichia coli K-12 MG1655 | 厌氧呼吸 | frdABCD | 延胡索酸还原酶 | 催化 | 有氧时上调50倍以上，参与甲基萘醌介导的电子传递 |
| Escherichia coli K-12 MG1655 | 厌氧呼吸 | yieF | NADH:甲基萘醌氧化还原酶 | 催化 | 有氧时上调约10倍 |
| Escherichia coli K-12 MG1655 | 厌氧呼吸 | wrbA | NADH:甲基萘醌氧化还原酶 | 催化 | 有氧时上调40倍以上 |
| Escherichia coli K-12 MG1655 | TCA循环 | sdhABCD | 琥珀酸脱氢酶 | 催化 | 有氧时下调25倍以上，受ArcA抑制 |
| Escherichia coli K-12 MG1655 | 发酵 | ldhA | D-乳酸脱氢酶 | 催化 | 有氧时上调3.36倍，产物D-乳酸 |
| Escherichia coli K-12 MG1655 | 调控 | arcA | ArcA转录调控因子 | 调控 | 有氧条件下被激活，导致厌氧表型 |
| Escherichia coli K-12 MG1655 | 调控 | arcB | ArcB传感器激酶 | 调控 | 响应醌库氧化还原状态，激活ArcA |
| Escherichia coli K-12 MG1655 | 调控 | fnr | FNR转录因子 | 调控 | 直接感应氧气，在有氧ECOM4LA中未显著激活 |
| Escherichia coli K-12 MG1655 | 糖酵解 | pgi | 磷酸葡萄糖异构酶 | 催化 | 有氧ECOM4LA中上调3.87倍 |
| Escherichia coli K-12 MG1655 | 糖酵解 | fbaB | 果糖二磷酸醛缩酶B | 催化 | 有氧上调8.77倍 |
| Escherichia coli K-12 MG1655 | 回补途径 | ppc | 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 | 催化 | 在ECOM4LA中OAA输入主要来自厌补反应 |
关键发现
- 敲除cydAB、cyoABCD、cbdAB和ygiN后，氧摄取率降至野生型的约1/60（0.21±0.16 vs 16.49±0.67 mmol/g DCW/h）
- ECOM4LA在有氧和无氧下均以D-乳酸为唯一副产物，有氧产率98%，无氧92%
- 生长率有氧0.32±0.005/h，无氧0.27±0.006/h
- 有氧下甲基萘醌含量达450±100 nmol/g DCW（野生型有氧主要为泛醌800±60 nmol/g DCW）
- ArcA regulon在ECOM4LA有氧时显著富集（P=4.5e-12），71%的差异表达ArcA靶基因与ArcA已知功能一致
- TCA循环通量几乎为零（OAA输入中厌补反应占99.5±1.4%，TCA循环仅0.5±1.4%）
- PPP通量相对糖酵解仅2%（野生型15%）
- NADH:menaquinone氧化还原酶wrbA上调40倍以上，frdABCD上调50倍以上，sdh下调25倍以上。
研究结论
去除末端氧化酶和奎醇单加氧酶使ECOM4LA无法利用氧，醌库由泛醌转为甲基萘醌，激活ArcB/ArcA系统，导致有氧条件下呈现厌氧代谢表型，菌株在有氧和无氧下生理行为相似，可作为生产还原性产物的平台菌株。