Improved Fermentation Performance of a Lager Yeast after Repair of Its AGT1 Maltose and Maltotriose Transporter Genes

作者: Vive Vidgren, Anne Huuskonen, Hannele Virtanen, Laura Ruohonen, John Londesborough
单位: 芬兰VTT技术研究中心，P.O. Box 1000, FI-02044 VTT，芬兰
杂志: Applied and Environmental Microbiology（2009）
DOI: 10.1128/AEM.01558-08
所属领域: 代谢工程
关键词: AGT1发酵性能拉格酵母高浓度酿造麦芽三糖转运麦芽糖转运
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解决的核心问题

拉格酵母的AGT1基因因含有一个提前终止密码子而无法编码功能性麦芽糖/麦芽三糖转运蛋白，导致高浓度（VHG）麦汁发酵缓慢、不完全，残留麦芽糖尤其是麦芽三糖含量高。

研究策略

从艾尔酵母A60克隆功能性AGT1基因，将其与来自酿酒酵母的组成型PGK1启动子连接，通过同源重组整合到拉格酵母A15的AGT1基因座，修复缺陷基因并实现组成型表达，从而增强麦芽糖和麦芽三糖的转运能力。

研究路线图

100%

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核心内容

拉格酵母因AGT1基因携带提前终止密码子而缺乏功能性麦芽糖/麦芽三糖转运蛋白，导致高浓度麦汁发酵缓慢且残糖偏高。本研究从艾尔酵母A60克隆完整的AGT1基因，连接组成型PGK1启动子后，通过同源重组整合回拉格酵母A15的AGT1基因座，实现了缺陷基因的修复与组成型表达。修复后，葡萄糖生长细胞的麦芽糖转运活性由1.6 U/g干酵母提升至5.1–10.3 U/g干酵母，麦芽三糖转运活性在麦芽糖生长细胞中也由3.4 U/g提高至5.1–8.5 U/g。在24°P麦汁发酵中，整合子发酵时间缩短11%–37%，乙醇产量从93 g/L提升至95–96 g/L，残留麦芽糖降低约1.5 g/L，麦芽三糖降低4–7 g/L。AGT1表达量较宿主提高2.6–12倍，且经110–112代非选择性传代后基因型和快速利用麦芽三糖的表型均保持稳定。该策略在不引入非酵母DNA、不改变酵母生长沉降及香气谱的前提下显著改善了高浓度酿造性能，为拉格酵母的高浓度发酵提供了有效途径。

创新点

首次成功修复拉格酵母AGT1基因并置于组成型启动子控制下；使用麦芽三糖-抗霉素A选择性平板有效筛选转化子；在不引入非酵母DNA的前提下显著改善高浓度麦汁发酵性能，且酵母生长、沉降及香气谱基本不变。

研究对象（6）

底盘细胞	代谢通路	基因	蛋白	功能	说明
拉格酵母A15（菌株A63015）	α-葡萄糖苷转运	AGT1（修复型）	Agt1	转运	从艾尔酵母A60获得的功能性AGT1基因，修复了A15内源基因的提前终止密码子，并受PGK1启动子驱动。
拉格酵母A15	基因表达调控	PGK1启动子	—	调控	来自酿酒酵母的组成型启动子，替换AGT1天然启动子，使AGT1在葡萄糖存在时也能表达。
艾尔酵母A60	α-葡萄糖苷转运	AGT1	Agt1	转运	作为功能性AGT1基因的供体，其序列用于修复拉格酵母的缺陷基因。
拉格酵母A15	α-葡萄糖苷转运	MTT1	Mtt1	转运	内源麦芽三糖转运蛋白基因，未被改造，但在研究中检测了其表达。
拉格酵母A15	α-葡萄糖苷转运	MALx1	Malx1	转运	内源麦芽糖转运蛋白基因，未被改造，但在研究中检测了其表达。
拉格酵母A15	麦芽糖代谢	MALx2	麦芽糖酶	催化	内源麦芽糖酶基因，未被改造，但检测了其表达水平。

关键发现

修复AGT1并组成型表达后，葡萄糖生长细胞的麦芽糖转运活性从1.6 U/g干酵母提高到5.1-10.3 U/g干酵母
麦芽糖生长细胞的麦芽三糖转运活性从3.4 U/g干酵母提高到5.1-8.5 U/g干酵母。在24°P麦汁发酵中，整合子的发酵时间缩短11%-37%，乙醇产量从93 g/L提高到95-96 g/L，残留麦芽糖降低约1.5 g/L，麦芽三糖降低4-7 g/L。AGT1表达量比宿主A15增加2.6-5.8倍（13h）和3.8-12倍（36h）。整合子经110-112代非选择性培养后仍保持稳定的基因型和快速适应麦芽三糖表型。

研究结论

修复拉格酵母AGT1基因并使其组成型表达可显著提高麦芽糖和麦芽三糖的转运能力，从而加速高浓度麦汁发酵、提高乙醇产量并降低残留糖，且不改变酵母的生长、沉降和香气特性，为高浓度酿造提供了有效策略。