Isolation and Characterization of Brewer's Yeast Variants with Improved Fermentation Performance under High-Gravity Conditions
- 作者
- Lies Bileck, Geert Toye, Françoise Dumortier, Kevin J. Verstrepen, Freddy R. Delvaux, Johan M. Thevelein, Patrick Van Dijk
- 单位
- Laboratory of Molecular Cell Biology, Institute of Botany and Microbiology, Katholieke Universiteit Leuven, and Department of Molecular Microbiology, Flanders Interuniversity Institute for Biotechnology (VIB), Kasteelpark Arenberg 31, B-3001 Leuven-Heverlee, Flanders, Belgium; Centre for Malting and Brewing Science, Department of Food and Microbial Technology, Katholieke Universiteit Leuven, Kasteelpark Arenberg 22, B-3001 Leuven-Heverlee, Flanders, Belgium
- 杂志
- Applied and Environmental Microbiology（2007）
- DOI
- 10.1128/AEM.02109-06
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
高浓度酿造中啤酒酵母（Saccharomyces pastorianus）发酵效率低，常出现发酵迟缓或不完全，酵母存活率下降，限制了更高浓度麦汁的使用。
研究策略
对工业拉格啤酒酵母CMBS33进行UV诱变或自发突变，通过连续多轮超高浓度麦汁（22-28°P）传代培养富集优良变异株；对筛选出的优良变异株进行全基因组表达分析，鉴定候选基因，并通过过表达验证其功能。
核心内容
该研究针对工业拉格啤酒酵母在高浓度麦汁发酵中效率低、存活率下降的问题，对商业菌株CMBS33分别进行UV诱变和自发突变，并通过多轮22–28°P超高浓度麦汁连续传代培养富集优良变异株。从中筛选出两个性能显著提升的非转基因变异株GT336（自发）和GT344（UV诱导）。在3.5L搅拌发酵罐、18°P、11°C条件下，两株变异株的最终乙醇浓度分别达到8.14%和8.10%（vol/vol），高于对照的7.75%；GT344在矮管发酵中最终表观浸出物比对照低约0.5°P，且变异株的乙醇耐受性、存活率均优于对照，发酵末期海藻糖含量显著低于对照。全基因组表达分析鉴定出多个候选基因，其中HXK2表达下调约2倍，LEU1在GT336和GT344中分别上调2.44倍和2.13倍（13.5°P时达6.48倍和3.11倍），过表达LEU1可加快17°P条件下的发酵速率。0.5°P的衰减改进可带来约3.54%的产能提升。该研究首次从工业拉格酵母中分离出高浓度发酵性能显著改善的非转基因变异株，并鉴定出LEU1等关键基因，为理解高浓度发酵的分子机制和工业菌株改良提供了可行途径，变异株风味特征基本保持，可直接用于工业生产。
创新点
首次从工业拉格酵母中筛选出高浓度条件下发酵性能显著提升的非转基因变异株；首次鉴定出影响高浓度发酵性能的基因（如LEU1、HXK2等）；建立了一种基于连续传代筛选的通用方法。
研究对象（13）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces pastorianus CMBS33 (工业拉格啤酒酵母) | 糖酵解 | HXK2 | 己糖激酶II (Hexokinase II) | 催化 | 在高浓度发酵初期表达下调约2倍，推测减弱葡萄糖阻遏，促进麦芽糖/麦芽三糖利用 |
| Saccharomyces pastorianus CMBS33 (工业拉格啤酒酵母) | 亮氨酸生物合成 | LEU1 | 异丙基苹果酸异构酶 (3-isopropylmalate isomerase) | 催化 | 表达上调2.44倍（GT336）和2.13倍（GT344），13.5°P时上调6.48倍和3.11倍；过表达提高发酵速率 |
| Saccharomyces pastorianus CMBS33 (工业拉格啤酒酵母) | 精氨酸生物合成 | ARG1 | 精氨基琥珀酸合成酶 (Argininosuccinate synthetase) | 催化 | 表达上调约2.4倍，过表达对发酵无影响 |
| Saccharomyces pastorianus CMBS33 (工业拉格啤酒酵母) | 未知 | ICY2 | 未分类蛋白 (Unclassified protein) | 调控 | 表达上调，过表达无影响，功能未知 |
| Saccharomyces pastorianus CMBS33 (工业拉格啤酒酵母) | 蛋白质合成（核糖体） | RPL8A | 核糖体蛋白L8 (Ribosomal protein L8) | 调控 | 在变异株中表达下调约2倍 |
| Saccharomyces pastorianus CMBS33 (工业拉格啤酒酵母) | 蛋白质合成（核糖体） | RPL22A | 核糖体蛋白22A (Ribosomal protein 22A) | 调控 | 在变异株中表达下调约2倍 |
| Saccharomyces pastorianus CMBS33 (工业拉格啤酒酵母) | 蛋白质合成（核糖体） | RPL5 | 核糖体蛋白L5 (Ribosomal protein L5) | 调控 | 在变异株中表达下调约2倍 |
| Saccharomyces pastorianus CMBS33 (工业拉格啤酒酵母) | 脯氨酸降解 | PUT1 | 脯氨酸氧化酶 (Proline oxidase) | 催化 | 在变异株中表达下调约2倍 |
| Saccharomyces pastorianus CMBS33 (工业拉格啤酒酵母) | 麦角固醇合成/甲羟戊酸途径 | HMG1 | 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶1 | 催化 | 在变异株中表达下调约2.4倍 |
| Saccharomyces pastorianus CMBS33 (工业拉格啤酒酵母) | 线粒体呼吸链 | NDE1 | 线粒体NADH脱氢酶 (Mitochondrial NADH dehydrogenase) | 能量供给 | 在变异株中表达下调约2倍 |
| Saccharomyces pastorianus CMBS33 (工业拉格啤酒酵母) | 脂质代谢 | PDR16 | 磷脂酰肌醇转移蛋白 (Phosphatidylinositol transfer protein) | 转运 | 在变异株中表达下调约2.5倍 |
| Saccharomyces pastorianus CMBS33 (工业拉格啤酒酵母) | 乙醛代谢 | ALD6 | 乙醛脱氢酶 (Acetaldehyde dehydrogenase) | 催化 | 在变异株中表达下调最高达5倍 |
| Saccharomyces pastorianus CMBS33 (工业拉格啤酒酵母) | 线粒体电子传递（细胞色素B家族） | YLR164w | 细胞色素B小亚基线粒体前体 | 能量供给 | 在变异株中表达下调约1.9倍 |
关键发现
- 筛选出两个高浓度发酵性能优良的变异株GT336（自发）和GT344（UV诱导），在超高浓度麦汁中发酵速率和最终衰减度均优于对照
- 在3.5L搅拌发酵罐、18°P、11°C条件下，CMBS33、GT336和GT344的最终乙醇浓度分别为7.75%、8.14%和8.10%（vol/vol）
- GT344在矮管发酵中表现出更好的最终衰减，Δ表观浸出物比对照低约0.5°P
- 变异株在发酵末期海藻糖含量显著低于对照（23°P时尤其明显）
- 全基因组表达分析发现HXK2表达下调约2倍，LEU1表达上调2.44倍（GT336）和2.13倍（GT344），在13.5°P时分别上调6.48倍和3.11倍
- 过表达LEU1在17°P、17°C条件下使发酵速率加快，但不影响最终衰减
- 5°P的衰减改进可带来约3.54%的产能增加，每罐（3000 hl）可多产106 hl啤酒（约32000瓶）
- 变异株的乙醇耐受性和存活率均高于对照。
研究结论
通过适当的筛选条件可从商业啤酒酵母中分离出高浓度发酵性能显著改善的变异株，这些变异株在发酵速率、衰减度和乙醇产量方面均有提升，且风味特征基本保持，可直接用于工业高浓度酿造；同时首次鉴定了与高浓度发酵性能相关的基因（LEU1、HXK2等），为理解其分子机制和进一步菌株改良提供了基础。