Characterisation of CYP101J2, CYP101J3 and CYP101J4, three 1,8-cineole-hydroxylating cytochrome P450 monooxygenases from Sphingobium yanoikuyae strain B2
- 作者
- Birgit Unterweger, Dieter M. Bulach, Judith Scoble, David J. Midgley, Paul Greenfield, Dena Lyras, Priscilla Johanesen, Geoffrey J. Dumsday
- 单位
- Department of Microbiology, Monash University; Infection and Immunity Program, Monash Biomedicine Discovery Institute, Monash University; CSIRO Manufacturing, Clayton; Victorian Life Sciences Computation Initiative, The University of Melbourne; CSIRO Manufacturing, Parkville; CSIRO Energy, North Ryde; CSIRO Oceans & Atmosphere, North Ryde
- 杂志
- Applied and Environmental Microbiology（2017）
- DOI
- 10.1128/AEM.02067-16
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
从Sphingobium yanoikuyae B2中鉴定和表征能够羟基化1,8-桉叶素的新型细胞色素P450酶，为合成羟基化1,8-桉叶素衍生物提供新的生物催化剂。
研究策略
结合基因组测序、基于1,8-桉叶素结合能力的天然蛋白纯化、异源表达与光谱学表征，以及重组全细胞生物转化，鉴定并验证了三个新的P450酶的功能。
核心内容
本研究从Sphingobium yanoikuyae B2菌株中鉴定并表征了三个新的细胞色素P450酶CYP101J2、CYP101J3和CYP101J4，它们均能催化1,8-桉叶素的羟基化。通过基因组测序、天然蛋白纯化、异源表达及光谱学分析，确认这些酶属于CYP101家族，但与已知的1,8-桉叶素羟基化酶P450cin序列同一性低于30%。在E. coli BL21(DE3)中，CYP101J2和CYP101J3产量超过30 mg/L，CYP101J4约1.5 mg/L；底物结合引起Soret峰从416–417 nm移至392–396 nm，无KCl时解离常数分别为20.4、22.1和8.4 μM，加入0.2 M KCl后降至10.1、9.5和5.1 μM。全细胞转化实验表明三个酶均能特异生成(1S)-2α-羟基-1,8-桉叶素或(1R)-6α-羟基-1,8-桉叶素，且羟基化取向为α型，不同于P450cin的β型。该发现扩展了CYP101家族的功能多样性，为1,8-桉叶素衍生物的绿色合成及工业应用提供了新的生物催化剂。
创新点
首次报道Sphingobium属细菌中的1,8-桉叶素羟基化P450；发现三个新的CYP101家族成员（CYP101J2/J3/J4），它们与已知的1,8-桉叶素羟基化酶序列同一性低（<30%），但能特异性产生α-羟基化产物；为CYP101家族进化和DNA改组提供了新父本酶。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 1,8-cineole hydroxylation | cyp101J2 (Sya_B2_03558) | CYP101J2 | 催化 | 来自Sphingobium yanoikuyae B2的1,8-桉叶素羟基化P450，重组表达并纯化，KD=20.4 μM（无KCl）或10.1 μM（0.2 M KCl） |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 1,8-cineole hydroxylation | cyp101J3 (Sya_B2_03538) | CYP101J3 | 催化 | 来自S. yanoikuyae B2，重组表达，KD=22.1 μM（无KCl）或9.5 μM（0.2 M KCl） |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 1,8-cineole hydroxylation | cyp101J4 (Sya_B2_02767) | CYP101J4 | 催化 | 来自S. yanoikuyae B2，重组表达量较低约1.5 mg/L，KD=8.4 μM（无KCl）或5.1 μM（0.2 M KCl） |
关键发现
成功分离并表征了来自S. yanoikuyae B2的三个新P450：CYP101J2、CYP101J3和CYP101J4。在E. coli BL21(DE3)中异源表达并纯化，产量分别为>30 mg/L（CYP101J2和J3）和约1.5 mg/L（CYP101J4）。光谱表征显示典型P450特征，1,8-桉叶素结合导致Soret峰从416-417 nm移至392-396 nm。KD值（无KCl）分别为20.4±2.6 μM、22.1±0.8 μM和8.4±0.6 μM，添加0.2 M KCl后分别降至10.1±1.0、9.5±0.5和5.1±0.1 μM。全细胞生物转化显示三个酶均能将1,8-桉叶素羟基化为(1S)-2α-羟基-1,8-桉叶素或(1R)-6α-羟基-1,8-桉叶素（GC-MS，m/z=170，与标准品保留时间对比）。与P450cin（CYP176A1）相比，这些酶氨基酸序列同一性<30%，且羟基化取向不同（α vs β）。β-紫罗酮诱导40%/35%的I型光谱位移，樟脑诱导5-20%，甲苯无诱导。
研究结论
本研究从S. yanoikuyae B2中鉴定并表征了三个新的1,8-桉叶素羟基化P450（CYP101J2、CYP101J3和CYP101J4），它们属于CYP101家族，能在E. coli中利用宿主电子传递链催化1,8-桉叶素羟基化，生成α-羟基化产物。这些酶扩展了1,8-桉叶素修饰的酶工具箱，为工业应用（如天然香料前体和聚合物合成）提供了基础。