Characterization of an Allylic/Benzyl Alcohol Dehydrogenase from Yokenella sp. Strain WZY002, an Organism Potentially Useful for the Synthesis of α,β-Unsaturated Alcohols from Allylic Aldehydes and Ketones
- 作者
- Xiangxian Ying, Yifang Wang, Bin Xiong, Tingting Wu, Liping Xie, Meilan Yu, Zhao Wang
- 单位
- College of Biological and Environmental Engineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou, China; College of Life Sciences, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou, China
- 杂志
- Applied and Environmental Microbiology（2014）
- DOI
- 10.1128/AEM.03980-13
- 所属领域
- 酶工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
解决α,β-不饱和醛酮选择性还原为α,β-不饱和醇的难题，化学催化剂易于还原C=C键，现有生物催化剂存在酶稳定性差、底物抑制等问题，需要发现更稳健的烯丙基/苄基醇脱氢酶。
研究策略
从土壤中筛选具有烯丙醇氧化活性的菌株Yokenella sp. WZY002，进行全细胞催化评估其化学选择性；纯化关键酶YsADH，克隆其编码基因并在大肠杆菌中异源表达，系统表征酶的pH/温度依赖、热稳定性、有机溶剂耐受性、底物谱和动力学参数。
核心内容
从土壤中筛选获得一株具有烯丙醇氧化活性的Yokenella sp. WZY002菌株，并从中鉴定出一种NADPH依赖的含锌中链醇脱氢酶YsADH。该酶经克隆后在大肠杆菌中异源表达，纯化后确认其为同源二聚体，亚基分子量约36.4 kDa。YsADH展现出优异的热稳定性与有机溶剂耐受性，在55°C下半衰期达6.2小时，于20% DMSO中孵育24小时仍保留87.5%的活性。酶学表征显示其还原苯甲醛的比活力高达427 U/mg，还原巴豆醛为399 U/mg，且对底物抑制的耐受性比同类酶高2至3个数量级。全细胞催化方面，WZY002在30°C、pH 8.0条件下还原50 mM巴豆醛可得到96.1%的巴豆醇产率，还原2-羟基苯乙酮则生成e.e.值大于99.9%的(S)-1,2-苯二醇。这些结果说明YsADH是一种兼具高催化活性、热稳定性和底物抑制耐受性的稳健生物催化剂，为α,β-不饱和醛酮选择性还原为相应不饱和醇提供了新的酶学工具，具有工业应用潜力。
创新点
首次报道Yokenella菌种用于合成烯丙基/苄基醇；YsADH具有高温活性（巴豆醛还原最适65°C，巴豆醇氧化最适55°C）、中等热稳定性（55°C半衰期6.2 h）、高有机溶剂耐受性（20% DMSO孵育24h保留87.5%活性）和高催化活性（苯甲醛还原427 U/mg）；对底物抑制具有较高耐受性，Kis值比同类酶高2-3个数量级。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Yokenella sp. WZY002 | 烯丙基/苄基醇氧化还原 | adh | YsADH | 催化 | 从土壤中筛选到的菌株，全细胞催化烯丙基醛/酮化学选择性还原为α,β-不饱和醇，同时具有芳香酮不对称还原活性 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 烯丙基/苄基醇氧化还原 | adh | 重组YsADH | 催化 | 作为异源表达宿主，携带pEASY-E1-adh质粒，经IPTG诱导表达N端组氨酸标签的YsADH，用于酶学表征 |
关键发现
- 分离得到Yokenella sp. WZY002，在30°C、pH
- 0下全细胞还原50 mM巴豆醛产巴豆醇，产率96.1%；还原(E)-辛-2-烯醛得trans-2-辛烯-1-醇68.7%并伴有27.0%酯副产物；还原2-羟基苯乙酮得(S)-1,2-苯二醇，e.e.>99.9%。纯化的YsADH亚基分子量36,411 Da，天然状态为同源二聚体（75±3 kDa）。重组酶严格依赖NADP(H)，巴豆醛还原最适pH
- 5、65°C，巴豆醇氧化最适pH
- 0、55°C。55°C半衰期6.2 h，60°C半衰期1.5 h，65°C处理30min残留30.8%活性。在20% DMSO中孵育24h残留87.5%活性。还原反应中苯甲醛活性最高427 U/mg，巴豆醛399 U/mg；氧化反应中巴豆醇活性最高79.9 U/mg。动力学参数：苯甲醛Km=0.4 mM，Kcat/Km=899 s⁻¹mM⁻¹；巴豆醛Km=3.3 mM，Kcat/Km=122 s⁻¹mM⁻¹；NADPH的Kcat/Km为720 s⁻¹mM⁻¹，NADP⁺为277 s⁻¹mM⁻¹；醇底物Kis比醛底物高约3-5倍，表明酶更偏好醛还原且对醇底物抑制更耐受。
研究结论
YsADH是一种NADPH依赖的含锌中链醇脱氢酶，天然形成同源二聚体，具有高催化活性、热稳定性和有机溶剂耐受性，能高效催化烯丙基/苄基醛还原为相应不饱和醇，且对底物抑制有较高耐受性，有望作为合成α,β-不饱和醇的稳健生物催化剂。