Identification and Characterization of the Rhizobium sp. Strain GIN611 Glycoside Oxidoreductase Resulting in the Deglycosylation of Ginsenosides
- 作者
- Eun-Mi Kim, Juhan Kim, Joo-Hyun Seo, Jun-Seong Park, Duck-Hee Kim, Byung-Gee Kim
- 单位
- 首尔大学化学与生物工程系；科罗拉多大学环境科学合作研究所；爱茉莉太平洋研发中心
- 杂志
- Applied and Environmental Microbiology
- DOI
- 10.1128/AEM.06404-11
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
从土壤中筛选具有人参皂苷化合物K脱糖活性的微生物，鉴定其新型脱糖酶并阐明其脱糖机制，以高效制备稀有人参皂苷元。
研究策略
采用富集培养从人参田土壤中筛选目标菌株，通过蛋白质纯化、肽段测序和基因克隆鉴定酶，并在大肠杆菌中异源表达，结合HPLC和质谱分析反应中间产物，揭示其通过氧化葡萄糖基团实现脱糖的新机制。
核心内容
本研究从人参田土壤中筛选到一株苜蓿根瘤菌Rhizobium sp. GIN611，其16S rRNA与Rhizobium sp. R-31762同源性达99.2%。通过富集培养、蛋白质纯化与肽段测序，鉴定出一种新型FAD依赖的糖苷氧化还原酶，该酶为异二聚体，大亚基63.5 kDa、小亚基17.5 kDa，二者以二硫键连接且基因在基因组中紧密连锁。在大肠杆菌中共表达两个亚基获得可溶活性酶，单独表达大亚基则形成包涵体。该酶以人参皂苷化合物K为底物时，动力学参数kcat为2.71 s⁻¹，Km为0.11 mM，kcat/Km达2.4×10⁴ M⁻¹s⁻¹；反应30分钟产物得率超过88%，1小时内底物被完全氧化，12小时内氧化型中间体完全脱糖生成PPD(S)。机制研究表明，该酶通过氧化葡萄糖基团触发自发脱糖，不同于经典β-葡萄糖苷酶的水解机制，且具有广泛底物特异性。这一发现为稀有人参皂苷及其他糖苷元的绿色生物制备提供了新的酶学工具和催化策略。
创新点
首次发现一种FAD依赖的糖苷氧化还原酶通过氧化人参皂苷的葡萄糖基而引发自发脱糖，该机制不同于经典的β-葡萄糖苷酶水解机制；该酶具有广谱底物特异性，可应用于多种糖苷类化合物的脱糖。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Rhizobium sp. GIN611 | 人参皂苷脱糖代谢 | 大亚基基因（GenBank JN683624） | 糖苷氧化还原酶大亚基 | 催化 | 催化CK氧化生成氧化型CK，随后自发脱糖生成PPD(S) |
| Rhizobium sp. GIN611 | 人参皂苷脱糖代谢 | 小亚基基因（GenBank JN683625） | 糖苷氧化还原酶小亚基 | 调控 | 辅助大亚基可溶表达，形成异二聚体 |
| Escherichia coli Rosetta-gami 2(DE3, pLysS) | 重组蛋白表达 | 大亚基基因（JN683624）和小亚基基因（JN683625）共表达于pETDuet-1 | 重组糖苷氧化还原酶大亚基和小亚基 | 催化 | 小亚基共表达使大亚基可溶，纯化后大亚基单独具有脱糖活性 |
| Escherichia coli BW25113(DE3)（含pBAD:groESL） | 重组蛋白表达 | 大亚基基因（JN683624）单独克隆到pET28b | 重组糖苷氧化还原酶大亚基 | 催化 | 单独表达时形成包涵体，即使有GroEL/GroES也不可溶 |
关键发现
- 筛选到Rhizobium sp. GIN611，其16S rRNA与Rhizobium sp. R-31762有99%同源性（99.2% identity, 1073/1081）
- 纯化的酶为异二聚体，大亚基分子量63.5 kDa，小亚基17.5 kDa，通过二硫键连接
- 大亚基基因与小亚基基因在基因组中紧密连锁，两基因重叠一个核苷酸
- 大亚基为FAD依赖的糖苷氧化还原酶，FAD与蛋白比例为1:1.9
- 最适pH为6.5，最适温度为55℃，Ca2+有轻微激活作用
- 动力学参数为kcat=2.71 s^-1，Km=0.11 mM，kcat/Km=2.4×10^4 M^-1 s^-1
- 以2 mM CK为底物反应30 min产物得率超过88%，1 h内CK完全氧化为氧化型CK，12 h内氧化型CK完全脱糖生成PPD(S)
- 小亚基共表达使大亚基可溶，单独表达大亚基形成包涵体。
研究结论
本文报道了一种来自苜蓿根瘤菌GIN611的新型FAD依赖糖苷氧化还原酶，它通过氧化糖基团实现脱糖，其机制与常见糖苷酶不同，且底物谱广，具有作为生物催化剂制备稀有人参皂苷和其他糖苷元的应用潜力。