A fivefold parallelized biosynthetic process secures chlorination of Armillaria mellea (honey mushroom) toxins
- 作者
- Jonas Wick, Daniel Heine, Gerald Lackner, Mathias Misiek, James Tauber, Hans Jagusch, Christian Hertweck, Dirk Hoffmeister
- 单位
- Department of Pharmaceutical Microbiology at the Hans Knöll Institute, Friedrich-Schiller Universität Jena, Beutenbergstrasse 11a, 07745 Jena, Germany; Department of Biomolecular Chemistry, Leibniz Institute for Natural Product Research and Infection Biology - Hans Knöll Institute, Beutenbergstraße 11a, 07745 Jena, Germany; Institute of Microbiology, Swiss Federal Institute of Technology (ETH), Vladimir-Prelog-Weg 1-5, 8093 Zürich, Switzerland
- 杂志
- Applied and Environmental Microbiology
- DOI
- 10.1128/AEM.03168-15
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
揭示蜜环菌（Armillaria mellea）中melleolide类毒素氯化修饰的生化与遗传基础，首次对担子菌卤化酶进行表征。
研究策略
从蜜环菌基因组中鉴定出五个编码推定的黄素依赖性卤化酶的基因（armH1–armH5），在Escherichia coli中异源表达并纯化重组蛋白，以melleolide F为底物进行体外卤化反应，结合HPLC和HR-ESIMS分析产物，并通过系统发育分析探讨真菌卤化酶的进化关系。
核心内容
该研究首次对担子菌来源的黄素依赖性卤化酶进行了生化表征，揭示了蜜环菌（Armillaria mellea）中melleolide类毒素氯化修饰的遗传与生化基础。研究从蜜环菌基因组中鉴定出五个编码推定卤化酶的基因（armH1–armH5），将其在Escherichia coli中异源表达并纯化重组蛋白，以melleolide F为底物进行体外卤化反应，结合HPLC和HR-ESIMS分析产物。结果表明，五个卤化酶均能独立催化底物的单氯化，高分辨质谱检测到[M-H]⁻为435.1581至435.1600的产物，与6'-氯melleolide F计算值一致，其中ArmH4催化活性最高，还能以溴离子为底物产生同位素峰接近1:1的6'-溴melleolide F，但未检测到碘化活性。所有酶均含有保守的GW(A/V)W(F/L)基序及活性位点赖氨酸，且五个基因均位于melleolide生物合成基因簇之外并含有内含子。系统发育分析显示真菌卤化酶形成单系群并分化为子囊菌和担子菌两个支系。该发现证明蜜环菌通过五个功能冗余的卤化酶确保毒素的6'-氯代，是一种前所未有的五重并行生物合成保障机制，但氯化的生理意义尚待阐明。
创新点
首次对担子菌卤化酶进行生化表征；发现天然产物生物合成中前所未有的五重并行（冗余）氯化步骤；证明这些卤化酶作用于游离底物，且基于细菌酶的功能分类（A/B组）不适用于真菌卤化酶。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | melleolide生物合成 | armH1 | ArmH1 | 催化 | 来自Armillaria mellea，异源表达于E. coli KRX，催化melleolide F的6'-氯化 |
| Escherichia coli | melleolide生物合成 | armH2 | ArmH2 | 催化 | 来自Armillaria mellea，异源表达于E. coli KRX，催化melleolide F的6'-氯化 |
| Escherichia coli | melleolide生物合成 | armH3 | ArmH3 | 催化 | 来自Armillaria mellea，异源表达于E. coli KRX，催化melleolide F的6'-氯化 |
| Escherichia coli | melleolide生物合成 | armH4 | ArmH4 | 催化 | 来自Armillaria mellea，异源表达于E. coli KRX，催化melleolide F的6'-氯化，且能催化溴化 |
| Escherichia coli | melleolide生物合成 | armH5 | ArmH5 | 催化 | 来自Armillaria mellea，异源表达于E. coli KRX，催化melleolide F的6'-氯化 |
| Escherichia coli | 辅酶再生 | fre | Fre | 催化 | 黄素还原酶，再生FADH2供卤化酶使用 |
关键发现
- 五个黄素依赖性卤化酶ArmH1–ArmH5均在体外催化melleolide F的单氯化，HR-ESIMS检测到[M-H]⁻分别为435.1581（ArmH1）、435.1595（ArmH2）、435.1600（ArmH3）、435.1584（ArmH4）、435.1579（ArmH5），与6'-氯melleolide F计算值m/z
- 1580一致。其中ArmH4产物形成最显著，且ArmH4还能以溴离子为底物催化溴化，产生m/z
- 1075和481.1056（接近1:1的同位素峰），对应6'-溴melleolide F；未检测到碘化。所有酶均含保守的GW(A/V)W(F/L)基序及活性位点赖氨酸（ArmH5为K77，其余为K76）。五个卤化酶基因均位于melleolide生物合成基因簇之外，且都含有内含子（armH1、armH2、armH3、armH5有9个，armH4有10个）。系统发育分析表明真菌卤化酶形成单系群，并明显分化为子囊菌和担子菌两个支系。
研究结论
蜜环菌通过五个功能冗余的卤化酶（ArmH1–ArmH5）确保melleolide毒素的6'-氯化，这是一种前所未有的五重并行生物合成保障步骤。这些酶属于游离底物型卤化酶，但基于细菌A/B组分类不适用于真菌酶。氯化的生理意义尚不明确。