Adenine Addition Restores Cell Viability and Butanol Production in Clostridium saccharoperbutylacetonicum N1-4 (ATCC 13564) Cultivated at 37°C
- 作者
- Keiji Kiyoshi, Sohei Kawashima, Kosuke Nobuki, Toshimori Kadokura, Atsumi Nakazato, Ken-ichiro Suzuki, Shunichi Nakayama
- 单位
- Department of Fermentation Science and Technology, Faculty of Applied Bio-science, Tokyo University of Agriculture, Tokyo, Japan
- 杂志
- Applied and Environmental Microbiology（2017）
- DOI
- 10.1128/AEM.02960-16
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
Clostridium saccharoperbutylacetonicum N1-4在37°C培养温度下生长和丁醇生产提前停止，原因不明，限制其工业应用
研究策略
通过代谢组学比较30°C和37°C培养的细胞内代谢物差异，筛选耗竭的代谢物并进行回补实验，鉴定关键限制因子
核心内容
该研究针对Clostridium saccharoperbutylacetonicum N1-4在37°C下生长和丁醇生产提前停止的问题，通过代谢组学比较30°C与37°C培养的胞内代谢物差异，发现腺嘌呤为关键耗竭因子。回补实验表明，添加250 mg/L腺嘌呤可使37°C下最大OD600从4.4升至4.5，丁醇产量从3.9 g/L提升至8.7 g/L，而30°C下补充腺嘌呤亦使OD600增至9.8。机制分析显示，37°C无补充时CFU在16小时后急剧下降、ATP水平20小时后降低且伴随大量孢子形成；补充腺嘌呤则维持CFU和ATP水平至36小时，并将孢子形成推迟至20小时后。在共培养体系中，34°C添加腺嘌呤使丁醇产量从1.9 g/L提高至6.1 g/L。结果表明腺嘌呤通过维持ATP水平和抑制孢子形成恢复细胞活力，从而恢复丁醇生产，证实嘌呤补救途径是高温限制的关键靶点，为菌株代谢改造提供了新思路。
创新点
首次证明腺嘌呤补充可通过维持ATP水平和抑制梭菌孢子形成来恢复细胞活力，进而恢复37°C下的生长和丁醇生产；提出基于代谢物水平的靶向通路增强新策略
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Clostridium saccharoperbutylacetonicum N1-4 (ATCC 13564) | 丁醇发酵（ABE途径） | — | — | 能量供给 | 主要研究菌株，37°C下生长和丁醇生产受限，补充腺嘌呤可恢复 |
| — | 嘌呤补救途径 | apt（推测） | 腺嘌呤磷酸核糖转移酶 | 催化 | 催化腺嘌呤与PRPP生成AMP，进而合成ATP，维持细胞能量状态 |
| — | 孢子形成调控 | codY（推测） | CodY | 调控 | 感知GDP/GTP水平，抑制孢子形成相关基因表达；腺嘌呤补充可能通过提高GTP水平抑制孢子形成 |
| Clostridium thermocellum NBRC103400 | 纤维素降解 | — | 纤维素酶 | 催化 | 共培养伴侣菌，水解纤维素为可发酵糖，供N1-4利用产生丁醇 |
关键发现
- 37°C培养时，最大OD600仅为4.4±0.0（30°C为12.4±2.0），丁醇产量仅3.9±0.2 g/L（30°C为11.7±0.2 g/L）。补充250 mg/L腺嘌呤后，37°C下最大OD600升至4.5±0.1，丁醇产量升至8.7±1.0 g/L
- 补充混合核苷碱基时OD600为4.8±0.1，丁醇为6.9±0.6 g/L。30°C补充腺嘌呤也使最大OD600增至9.8±0.5。共培养中，34°C添加腺嘌呤使丁醇产量从1.9±1.5 g/L提高到6.1±0.6 g/L，37°C从低于检测限提高到1.0±0.7 g/L。37°C无补充时CFU在16h后急剧下降，ATP水平在20h后下降，16h内大量孢子形成
- 补充腺嘌呤则使CFU维持至36h、ATP维持至36h、孢子形成推迟至20h后
研究结论
腺嘌呤是C. saccharoperbutylacetonicum N1-4在37°C下生长和丁醇生产的关键限制代谢物；补充腺嘌呤通过维持细胞内ATP水平和抑制孢子形成恢复细胞活力，从而恢复丁醇生产。代谢组学与补料回补结合可有效鉴定限制性代谢通路，为菌株改造提供新靶点